CRBN je účinně degradován VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs
PROTAC technologie využívá E3 ligázy zničit cílové proteiny. Tak jsme přemýšleli, zda E3 ligázy sám o sobě může být ubiquitní a degradován tím, že další E3 ligázy-li dva různé E3 ligázy jsou umístěny v blízkosti. Degradátory VHL mohou být potenciálně náhražkami erytropoetinu aktivací HIF1a. Design, jsme připojen pomalidomide, CRBN-cílení molekuly, VHL032, VHL E3 ligázy ligand (Obr. 1A). Linker připojen amino skupina pomalidomide a terminálu acetyl skupina VH032; protože tyto jsou rozpouštědla-exponovaných oblastech, spojení mezi nimi by se pravděpodobně nebude ničit jejich vazba na každé E3 ligázy. Pro syntézu VHL-CRBN heterodimerizujících Protaců (obr. 1B a doplňkový obr. S1A), 4-fluorothalidomid (1) a VHL ligand (5) byly připraveny podle dřívější33. 4-Fluorothalidomide (1) byl léčen čtyři amine linkery (2) s terc-butyl ester skupiny v přítomnosti N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) v dimethyl sulfoxidu (DMSO) za vzniku meziproduktu (3). Následující deprotection terc-butylová skupina, ve 3 působením trifluoroctové kyseliny (TFA) v dichlormethanu (DCM), kyselina (4) byl spolu s VHL ligand (5 nebo 7) v přítomnosti 1–1H-1,2,3-triazolopyridinium 3-oxid hexafluorofosfát (HATU) a DIPEA, aby výnos PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 a TD-487 (8).
CRBN je účinně degradován VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs. A) schéma PROTACU obsahujícího pomalidomid a ligandu VHL (VH032). B) konstrukce TD-158, TD-165, TD-343 a TD-487. (C) buňky HEK293T byly ošetřeny TD-158, TD-165, TD-343 nebo TD-487 (0,1, 1 a 10 µM) po dobu 24 hodin a hladiny proteinu VHL byly analyzovány imunoblotováním. L. E. označuje dlouhou expozici Západní skvrny. D) DC50 graf sloučenin TD-158 a TD-165 (TD-165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). E) HA-CRBN a Flag-VHL byly vyjádřeny v buňkách HEK293T. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny TD-158 (500 nM) po dobu 24 hodin. Celé buněčné lyzáty byly analyzovány imunoblotováním indikovaných proteinů. (F) buňky HEK293T byly ošetřeny 500 nM TD-158 v různých časových bodech a hladiny CRBN byly analyzovány imunoblotováním. L. E. označuje dlouhou expozici Západní skvrny.
po ošetření těmito sloučeninami jsme zkoumali hladiny VHL a CRBN analýzou Western blot. Léčba TD-158, TD-165 nebo TD-343 způsobila pokles hladiny crbn proteinů v závislosti na koncentraci (obr. 1C, horní panel). Hladiny jak VHL dlouhé formy, tak VHL krátké formy se však zvýšily, pravděpodobně v důsledku stabilizace chemicko-proteinovou interakcí (obr. 1C, horní-střední a dolní-střední panely) 34. V případě léčby s 10 µM TD-158, CRBN úrovně byly obnoveny; tento „háček“ efekt je typický rys, který se vyskytuje v souvislosti s vysokou dávkou PROTAC-indukovaný protein degradation9,35,36,37. TD-487, stereoizomer TD-165, však nedokázal vyvolat degradaci CRBN (obr. 1C). TD-343 má relativně slabou aktivitu, což znamená, že začlenění kyslíku do linker inhibuje protac aktivitu. Kvantitativní reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) analýza ukázala, že snížení hladiny CRBN vyvolané VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs nedošlo v důsledku změny v mRNA (Doplňkový Obr. S1B). Hodnoty 50% degradační koncentrace (DC50) a maximální degradace (Dmax) byly měřeny pro všechny syntetizované sloučeniny. Vypočtené hodnoty DC50 a Dmax pro TD-158 byly 44,5 nM a 97.1% a odpovídající hodnoty pro TD-165 byly 20,4 nM a 99,6% (obr. 1D a doplňkový obr. S1D). Kratší linker-obsahující degrader TD-156 (DC50 = 100.6 nM, Dmax = 96.9%), zobrazí se slabší aktivitu ve srovnání s TD-165 (Doplňkový Obr. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), s kyslíkem začleněným do linkeru, vedlo k neefektivní degradaci CRBN. Abychom otestovali účinek vazby na thalidomid, zkoumali jsme degradaci CRBN heterodimerizujícími Protaky VHL-CRBN s jinou vazbou. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), s glykolová vazby, a TD-033 (DC50 = 2546.1 nM), se amidové vazby, vykazovaly sníženou CRBN rozkladu, vzhledem k tomu, že TD-759 (DC50 = 28.8 nM), s glycinem vazby, zobrazí potence podobné TD-165. K určení, zda relativní hladiny proteinu by mohlo přispět k této neobjektivní degradace proteinů, léčili jsme buňky se zvýšenou expresí VHL, CRBN, nebo jak s TD-158, a analyzovány CRBN a VHL úrovně. Ve všech případech byly hladiny CRBN sníženy, zatímco hladiny VHL zůstaly podobné nebo zvýšené (obr. 1E). V čase-průběh experimentů, TD-158 degradován CRBN o více než 80% ve 3 h a zcela degradován po 12 h (Obr. 1F). Degradace CRBN indukovaná TD-158 byla také pozorována v různých liniích lidských buněk (Doplňkový obr. S2A-D–.
Degradace CRBN tím, VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs je závislá na CRL2VHL
ověřte, zda CRBN degradaci TD-158 byl závislý na UPS nebo Cullin-RING ubiquitin ligázy (CRL), testovali jsme bortezomib, proteazomový inhibitor, a MLN4924, neddylation inhibitor. Současná léčba TD-158 a bortezomibem nebo MLN4924 zabránila degradaci CRBN (obr. 2A a doplňkový obr. S3A). Jak se očekávalo, tvorba poly-ubichitinového řetězce se výrazně zvýšila v přítomnosti TD-158(obr. 2B). Kromě toho knockdown VHL malou interferující RNA (siRNA)oslabil degradaci CRBN indukovanou TD-158 v buňkách HEK293T (obr. 2C). Naproti tomu exprese VHL v 786-o buňkách, buněčné linii renálního karcinomu s deficitem VHL, obnovila degradaci CRBN indukovanou TD-158 (obr. 2D). V souladu s těmito výsledky siRNA-zprostředkované vyřazující Cullin2, lešení proteinu CRL2VHL komplexu, brání TD-158–indukované CRBN degradace (Obr. 2E). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že degradace CRBN heterodimerizujícími Protacy VHL-CRBN je závislá na komplexu CRL2VHL.
Degradace CRBN tím, VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs je závislá na CRL2VHL. (A) HEK293T buňky byly ošetřeny s TD-165 (1 µM) po dobu 12 h, následuje přidání bortezomibu (20 nM) nebo DMSO po dobu 8 h. Celobuněčné lyzáty byly podrobeny immunoblot analýzy pro uvedené proteiny. (B) CRBN (CRBN-Flag) a Ha-tagged Ubiquitin (HA-Ub) byly exprimovány v buňkách HEK293T. Po 24 h byly buňky ošetřeny TD-158 (500 nM) a bortezomib (20 nM) nebo DMSO a bortezomibu (20 nM) po dobu 12 h. Celobuněčné lyzáty a proteiny immunoprecipitated pomocí Vlajky M2 magnetické korálky byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. C) buňky HEK293T byly transfektovány siRNA specifickou pro VHL nebo míchanou (kontrolní) siRNA. Po 24 h byly buňky ošetřeny TD-158 (500 nM) po dobu 24 h. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (D) 786-O buňky a VHL-vyjádření 786-O buňky (786-O + VHL) byli léčeni TD-158 (500 nM) po dobu 24 h. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (E) HEK293T a CUL2 – knockdowned HEK293T buňky byly ošetřeny s TD-165 (1 µM) nebo TD-487 (1 µM) na 24 h a celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu. F) CRBN-Flag byl vyjádřen v buňkách HEK293T. Po 36 h, buňky byly ošetřeny s TD-158 (1 µM) a bortezomib (20 nM) nebo DMSO a bortezomibu (20 nM) po dobu 12 h. Celobuněčné lyzáty a proteiny immunoprecipitated pomocí Vlajky M2 magnetické korálky byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. G) purifikované proteiny CRBN a komplex VHL / ELOB/ELOC byly smíchány a alikvotovány do čtyř zkumavek. TD-158 a glutathion korálky byly přidány, jak je uvedeno a inkubovány po dobu 3 h. Po inkubaci, glutathion korálky byly promyty a analyzovány pomocí imunoblotingu a Coomassie modří.
Efektivní degradace PROTACs vyžaduje vytvoření ternární komplex s cílový protein a E3 ligase9,38. Abychom to otestovali, provedli jsme koimunoprecipitační experimenty. Zjistili jsme, že exogenně vyjádřil Flag-tagged CRBN co-immunoprecipitated endogenní VHL v přítomnosti TD-158, ale ne v jeho nepřítomnosti (Obr. 2F). GST pull-down experimenty s použitím purifikovaných proteinů ukázaly, že CRBN přímo interagoval s komplexem VHL-Elongin B/C v přítomnosti TD-158 (obr. 2G). Navíc přidání přebytečného pomalidomidu nebo ligandu VHL inhibovalo degradaci CRBN indukovanou TD-158 (Doplňkový obr. S3B, C). Exogenně exprimovaný CRBN Y384 / W386A (AA), defektní mutant vázající pomalidomid16, nebyl TD-158 degradován (Doplňkový obr. S3D). Tato data tedy naznačují, že tvorba ternárního komplexu mezi CRBN, VHL a TD-158 je předpokladem degradace CRBN.
globální proteomic analysis ukazuje, že TD-158 indukuje degradaci CRBN
zkoumat degradaci CRBN v objektivní módní, provedli jsme kvantitativní proteomic analysis. Minimalizovat vedlejší účinky CRBN degradace, chovali jsme se k Jurkat buněk, které vyjádřil CRBN a IMiD neo substráty, s TD-158 nebo DMSO (kontrola vozidla) po dobu 12 h. Proteinů z každého vzorku byly stravitelné a stravitelné peptidy byly označeny pro izobarický označení spolu se kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie. Tato analýza identifikovala 7 148 proteinů obsahujících více než tři redundantní jedinečné peptidy (doplňková tabulka S1). Pouze tři proteiny—CRBN, CNIH1 a LMBRD2—splnily kritéria hodnoty P = 0,05 a více než 1,5 násobné změny. Mezi nimi byl CRBN jediným proteinem, který se změnil více než 2krát (obr. 3A). Nicméně, úrovně ostatních složek CRL4CRBN komplexy (CUL4A, CUL4B, DDB1, a RBX1) a CRL2VHL komplexy (elongin C , elongin B , CUL2, a RBX1) zůstal beze změny (Obr. 3B,C). Zajímavé je, že hladiny dříve hlášených neo-substrátů Imidů, včetně IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 a ZNF653, nebyly při léčbě TD-158 změněny (obr. 3B) 39,40,41. Tyto výsledky byly potvrzeny imunoblotováním v Jurkat a různých buněčných liniích mnohočetného myelomu (obr. 3D a doplňkový obr. S2A-D–.
Globální proteomic změny na TD-158 léčby. (A) sopečný graf proteinů identifikovaných kvantitativními proteomickými analýzami porovnávajícími lyzáty z buněk Jurkat léčených po dobu 12 hodin s 1 µM TD-158 nebo DMSO. Data představují tři biologické repliky. Osa x představuje násobnou změnu hladin proteinů v logaritmické stupnici a osa y představuje hodnotu P v logaritmické stupnici. (B) Relativní hojnost CRL4CRBN komplex, CRL2VHL složité, a neo-substrát CRBN (*P < 0.05, **P < 0.1). Červená čára označuje 1,5 násobný rozdíl. (C) Jurkat buňky byly ošetřeny s TD-158 (1 µM) nebo DMSO po dobu 24 h. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro CRL4CRBN složité bílkoviny. (D) Jurkat buňky byly ošetřeny s nebo bez DMSO, TD-158 (1 µM), pomalidomide (1 µM), nebo VHL ligandu (1 µM) na 24 h. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny.
CRBN degradace VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs rekapituluje a CRBN nedostatek
endogenní substrát CRL4CRBN je glutamin syntetáza GLUL, což je klíčový enzym v biogeneze glutaminu. Na acetyltransferázu CBP/p300 acetylates dvě N-terminální lysin rezidua GLUL v podmínkách vysoké hladiny glutaminu, a výsledný acetylovaný GLUL je zajat a ubiquitní tím, CRL4CRBN a následně odstraněna proteasomes22. Zkoumat vliv TD-158 na GLUL úrovně, hladověli jsme Hep3B buňky glutaminu po dobu 48 h a pak doplnění zásob glutaminu v přítomnosti nebo nepřítomnosti TD-158. TD-158 indukovala degradaci CRBN bez ohledu na stav glutaminu a hladiny GLUL se v průběhu času snižovaly pomaleji v přítomnosti TD-158 než v jeho nepřítomnosti (obr. 4A,B). Kromě toho in vivo ubikvitinační testy ukázaly, že ubikvitinace GLUL se snížila v přítomnosti TD-158 (obr. 4C). Zkoumali jsme také, zda léčba TD-165 poskytuje buněčnou rezistenci na IMiD. Dva IMiD-citlivé buněčné linie, WSU-DLCL2 a RPMI8226, byly předem ošetřeny TD-165 nebo DMSO po dobu 24 h, a pak se zpracuje s pomalidomide, TD-165, nebo oba pro 3 d. Pre-ošetření s TD-165 snížena na anti-proliferační účinky pomalidomide v obou buněčných linií (Obr. 4D, E). Společně tyto údaje naznačují, že degradace CRBN heterodimerizujícími Protacy VHL-CRBN rekapituluje nedostatek CRBN.
CRBN degradace VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs rekapituluje a CRBN nedostatek. (A) Hep3B buňky byly glutamin-vyhladověl a zacházet s TD-158 (500 nM) po dobu 48 h. Buňky byly pak léčeny s glutaminem (4 mM) v různých časových bodech. Degradace GLUL byla analyzována imunoblotováním. B) kvantitativní výsledky tří nezávislých experimentů. C) GLUL-Myc a V5-Ub byly exprimovány v buňkách HEK293T. Po 24 h byly buňky ošetřeny TD-158 (500 nM) nebo DMSO po dobu 12 h a pak léčeni bortezomibem (100 nM) nebo DMSO po dobu 12 h. Celobuněčné lyzáty a proteiny immunoprecipitated Myc pomocí magnetické korálky byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (D,E) buňky WSU-DLCL2 (D) a RPMI8226 (E) byly předběžně ošetřeny TD-165 (1 µM) nebo DMSO po dobu 24 hodin a po sklizni byly rozděleny do čtyř skupin. Každá skupina byla poté ošetřena pomalidomidem (1 µM) a DMSO nebo pomalidomidem (1 µM) a TD-165 (1 µM) po dobu 3 d. Životaschopnost buněk byla měřena pomocí CellTiter-Glo (**P < 0.001, *P < 0.01).
zkoumat in vivo účinky VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs, jsme se pokoušeli zjistit, zda TD-165 může vyvolat CRBN degradace na zvířecích modelech. I když aminokyselinových zbytků v myši CRBN (mCRBN) důležité pro teratogenitu nejsou zachovány, mCRBN byl výrazně degradován, i když v poněkud menší míře, TD-165 v myších embryonálních fibroblastů (Doplňkový Obr. S4A). Potom jsme podávali TD-165 intraperitoneálně myším, abychom zjistili, zda TD-165 indukuje degradaci CRBN in vivo. Hladiny CRBN se však nezměnily ve slezině, mononukleárních buňkách periferní krve (pbmc)nebo játrech (Doplňkový obr. S4B). Vzhledem k tomu, že farmakokinetika TD-165 jsou přiměřené (Doplňující Tabulky S2), tento nedostatek vliv může být přiřaditelné k vysoké vazbě na plazmatické proteiny (99.9%) TD-165 (Doplňující Tabulka S3).
N-terminálně zkrácený CRBN není degradován VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs
určit, které domény CRBN je důležité pro TD-165–zprostředkované CRBN degradace, jsme vytvořili sérii CRBN deleční mutanty (D1–D4), jak je znázorněno na Obr. 5A. Buněk exprimujících full-délka CRBN nebo individuální smazání mutanti byli léčeni buď DMSO nebo TD-165, a buněčné lyzáty byly zkoumány pro rozklad po TD-165 léčby. Překvapivě žádný ze čtyř delečních mutantů CRBN nebyl degradován TD-165, zatímco CRBN v plné délce byla účinně degradována (obr. 5B). Zejména, VHL byly hladiny mírně zvýšené, zřejmě kvůli stabilizaci chemické-proteinové interakce v přítomnosti TD-165, ale nemění výraz zkrácen CRBN mutanti v přítomnosti TD-165 (Obr. 5B). Jedním z možných vysvětlení by byla neschopnost delečních mutantů vytvořit ternární komplex. Mutant D1 však vytvořil ternární komplex s TD-165 a VHL (obr. 5C) a ubikvitinace D1 se zvýšila za přítomnosti TD-165 (obr. 5D). Poté jsme předpokládali, že pro ubikvitinaci jsou vyžadovány amino-terminální lysinové zbytky CRBN. Pro testování této myšlenky jsme substituovali všechny tři zbytky lysinu v N-konci CRBN (a.a. 1-80) argininem, jednotlivě i v kombinaci, a poté zkoumali buněčné lyzáty pro degradaci CRBN. TD-158 účinně degradoval všechny mutanty ve stejném rozsahu jako CRBN divokého typu (obr. 5E), což znamená, že tří lysinových zbytků na N-konci CRBN nejsou nutné pro degradaci vyvolané VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs.
N-terminální neuspořádané oblasti CRBN je nezbytná pro degradaci, ale ne pro ubikvitinace, VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs. (A) schematický diagram znázorňující mutanty zkrácení CRBN. Lon, Lon proteázová doména; TB, thalidomidová vazebná doména. (B) Xpress značené plné délky CRBN nebo D1, D2, D3 nebo D4 deleční mutanty byly exprimovány v buňkách HEK293T. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny TD-165 (3 µM) nebo DMSO po dobu 24 hodin. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány imunoblotováním indikovaných proteinů. (C)plazmidy kódující D1 značené Xpress a VHL označené His-SBP byly transfektovány do buněk HEK293T. Po 48 h byly buňky ošetřeny TD-165 (1 µM) nebo DMSO po dobu 24 h. Celobuněčné lyzáty a proteiny pull-sestřelil pomocí streptavidin korálky byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (D) plazmidy kódující Xpress značené CRBN, k39r, K42/43 R nebo K39/42/43 R mutanty byly transfektovány do buněk HEK293T. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny TD-158 (2 µM) nebo DMSO po dobu 24 hodin. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány imunoblotováním indikovaných proteinů.
neuspořádané oblasti cílené protein je nutné pro efektivní PROTAC-indukované degradaci
dále Jsme se snažili zjistit, strukturální rozdíly mezi full-délka CRBN a CRBN deletovaný mutant D1. Předpokládalo se, že N-konec CRBN (a.a. 1-80) bude obsahovat rozloženou nebo vnitřně neuspořádanou oblast na základě analýzy IUPred2A (Doplňkový obr. S5A). Tento neuspořádaný region (také znám jako 1-48) byl ve krystalové struktuře CRL4CRBN skutečně nerozeznatelný díky své flexibilitě (položka PDB; 6BN7). Bylo prokázáno, že vnitřně neuspořádané oblasti je jednou z hlavních složek proteasomal degron a působí jako iniciátor pro proteasomal proteolysis25. Alternativně, v případě globulární proteiny bez neuspořádané oblasti, p97/valosin-obsahující bílkoviny (p97/VCP) komplex se může rozvinout sekundární strukturu, která usnadňuje proteiny‘ proteasomal degradace. Zkoumat vztah mezi PROTAC-indukované degradaci proteinů a p97/VCP složité, jsme testovali vliv N2,N4-dibenzylquinazoline-2,4-diamin (DBeQ), p97/VCP inhibitor, na TD-165–indukované CRBN degradace. Tyto experimenty ukázaly, že degradace CRBN nebyla ovlivněna léčbou DBeQ (obr. 6A). Hladiny transkriptu 3 indukovatelného poškozením DNA (DDIT-3; CHOP) a lipidovaného LC-3II, používaného jako pozitivní kontrola, byly po léčbě DBeQ zvýšeny. Vyřazující p97 pomocí siRNA nebo DBeQ léčbu postižené ERAD a autofagie cest, což vede k upregulace KOTLETA, dobře zavedené UPR značku, a hromadění LC-3II, reprezentativní marker autofagie, respektive (Obr. 6A) 42. Proto, aby prošetřila, zda neuspořádané oblasti CRBN usnadňuje PROTAC vyvolané proteasomal degradace, jsme připojen neuspořádané oblasti (.a. 1-80) CRBN do D2, D3 a D4 mutanti a zkoumal chimerické proteiny pro degradaci. Všechny chimérické proteiny, zejména chiméra D4, byly degradovány TD-165 způsobem závislým na koncentraci (obr. 6B). Zavedení neuspořádané oblasti CRBN do n-nebo C-konce VHL však neindukovalo degradaci fúzního proteinu (obr. 6C), což naznačuje, že připojení neuspořádané oblasti není dostatečné pro všechny cílené proteiny. Rozšířit tuto myšlenku do rozkladu, vyvolané tím, že další PROTACs, testovali jsme ARCC4, dříve hlásil, androgenní receptor (AR) PROTAC43, protože AR také skýtá rozloženém region na N-konci (.a. 1-330), jak bylo stanoveno pomocí analytického nástroje IUPred2A (Doplňkový obr. S5B). Po ošetření ARCC4 byl AR bez N-terminální neuspořádané oblasti (ΔN330) degradován méně účinně než ar v plné délce. Zajímavé je, že připojení neuspořádané oblasti CRBN (a.a. 1-80) K AR ΔN330 zvýšilo účinnost degradace (obr. 6D a doplňkový obr. S5C). V souladu s tím, připevnění AR neuspořádané oblasti (.a. 1-170) CRBN D1 mutant také povýšen proteolýzy u TD-165 (Obr. 6E a doplňkový obr. S5D).
neuspořádané oblasti cílené protein je nutné pro efektivní rozklad podle PROTACs. (A) HEK293T buňky byly ošetřeny s TD-165 (1 µM), p97/VCP inhibitor DBeQ (10 µM), nebo obě za 6 h. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (B) N-terminální CRBN (.a. 1-80) byl vložen do N – nebo C-konci Jeho-SBP–tagged VHL plasmidu, a plasmidy byly vyjádřeny v HEK293T buňkách. Po 8 hodinách byly buňky sklizeny a rozděleny do čtyř skupin. Každá skupina se pak zpracuje s rostoucí koncentrací TD-165 48 hodin. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. C) plazmidy exprimující N-konec CRBN (a.a. 1-80) fúzované s D2, D3 nebo D4 byly transfektovány do buněk HEK293T. Po 8 hodinách byly buňky sklizeny a rozděleny do čtyř skupin. Každá skupina se pak zpracuje s rostoucí koncentrací TD-165 48 hodin. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny. (D) Plazmidů exprimujících full-délka AR, N-terminálně odstraněny AR (ΔN330), nebo N-konci CRBN (.a. 1-80) kondenzovaný na ΔN330 (CRBN (.a. 1-80) +ΔN330) byly transfektovaly do HEK293T buněk. Po 8 hodinách byly buňky sklizeny a rozděleny do čtyř skupin. Každá skupina byla poté ošetřena zvyšujícími se koncentracemi ARCC4 po dobu 24 hodin. celobuněčné lyzáty byly analyzovány imunoblotováním indikovaných proteinů. (E) Plazmidů exprimujících full-délka CRBN, D1 deletovaný mutant, nebo N-konci (AR.a. 1-170) kondenzovaný na D1 (AR (1-170) +D1) byly transfektovaly do HEK293T buněk. Po 8 hodinách byly buňky sklizeny a rozděleny do čtyř skupin. Každá skupina se pak zpracuje s rostoucí koncentrací TD-165 48 hodin. Celobuněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotingu pro uvedené proteiny.
Pro další posílení těchto zjištění, jsme vybrali PROTACs s vysokou energií (DC50 < 1 µM) na základě literární rešerše, a pak analyzovány na vnitřně neuspořádané oblasti použití IUPred2A nástroj. Zajímavé je, že dvě třetiny z vybrané PROTAC cílené proteiny bylo zjištěno, že mají neuspořádaný region více než 40 aminokyselin, a to buď v jednom z jejich termini, nebo interně (Tabulka 1)44, i když aminokyselinové sekvence založené na predikci neuspořádané nebo nestrukturovaných oblastech nebere další faktory, jako je například protein-proteinové interakce nebo post-translační modifikace, do consideration44,45,46. V souladu s tím, bylo prokázáno, že VHL-Homo-PROTAC indukuje degradaci dlouhé formy VHL, který skrývá neuspořádanou oblast na svém n-konci, ale ne VHL krátká form47. To tedy podporuje naši myšlenku, že neuspořádaná oblast cílených proteinů je nutná pro účinnou degradaci Protacy.
