Výsledky

nejprve posoudit, zda CD63 a H,K-Atpázy umístěny ve stejné subcelulární prostoru v žaludečních parietálních buňkách. Předchozí práce ukázaly, že parietální buňky potkanů exprimují vysoké hladiny CD63 (22). Imunofluorescenční mikroskopie na zmrazených částech žaludku potkanů naznačuje, že CD63 je přítomen ve většině buněk v žaludku potkanů, včetně parietálních buněk (obr. 1A). CD63 částečně kolokalizuje s HKa v parietálních buňkách. Dále jsme analyzovali vysoce čištěný přípravek TVE z prasečího žaludku (laskavý dárek od C. T. Okamoto). H, K-ATPáza přispívá ≈50% obsahu bílkovin v podobných přípravcích (23). Analýza Western blot ukazuje, že CD63 je hojně přítomen v tomto vyčištěném přípravku TVE (obr. 1B).

, Aby prošetřila možné v místě interakce mezi CD63 a H,K-Atpázy, provedli jsme pull-down experimenty pomocí biotinylated rajčatový lektin. Předchozí studie ukázaly,že tento lektin se specificky a jedinečně váže na HKß v žaludečních přípravcích (24-27). Jsme blotovány na TVE přípravek s anti-HKß mAb a biotinylated rajčatový lektin potvrdit, že lektin associates konkrétně s glykosylovaný HKß (Obr. 1C). Poté jsme použili biotinylovaný lektin rajčete k izolaci proteinů, které interagují s HKß v přípravku TVE. Analýza Western blot ukazuje, že CD63 se vysráží lektinem z rajčat (obr. 1D), prokazující, že CD63 a H,K-Atpázy associate in situ, a naznačuje, že tato asociace může být fyziologicky relevantní. Předčištění TVE příprava s 4% SDS, následuje 20-ti násobném zředění v lysis buffer, výrazně snižuje množství CD63, že se vysráží. Množství hkß, které bylo vysráženo, nebylo tímto ošetřením změněno (údaje nejsou uvedeny). Tyto údaje naznačují, že přítomnost CD63 v pull-down je přičíst jeho asociace s HKß a ne na přímý vztah mezi CD63 a rajčatový lektin.

zkoumat funkční význam interakce mezi CD63 a HKß dále jsme transfektovaly COS-7 buňkách pomocí cDNA kódující králík HKß buď jednotlivě, nebo společně s cDNA kódující FLAG-tagged CD63 construct (CD63-FL). Ukázali jsme, že HKß se nemusí shromažďovat s HKa, aby dosáhl buněčného povrchu v transfekovaných COS buňkách (20). Použili jsme CD63 konstrukt, který nese FLAG epitope tag na jeho N konci, protože C terminus CD63 obsahuje tyrosin-based motiv, který je nutný pro intracelulární obchodování tohoto tetraspanin (13).

COS buňky cotransfektované hkß a CD63-FL byly podrobeny imunoprecipitaci pomocí Anti-FLAG pAb. Analýza Western blot imunoprecipitovaného materiálu naznačuje, že hkß koprecipituje s CD63 (obr. 2, HKß + CD63-FL). Proteiny CD63-FL a HKß koimunoprecipitují v různých detergentech, včetně 2% CHAPS, 1% Brij 96 a 1% Triton X-100. Asociace mezi CD63 a HKß představuje jednu z mála tetraspanin komplexy popsáno, že přežije solubilization v Triton X-100 a je tedy pravděpodobné, že představují přímé interakce (28). Β-podjednotka má dvě formy: ßm (zralý), který je modifikován komplexními sacharidy, a ßc (jádro), který je modifikován sacharidy s vysokým obsahem manózy (29). Obě formy koprecipitují s CD63, i když poměr ßc k ßm ve sraženině se mění v závislosti na podmínkách solubilizace.

HKß nebyla zjištěna VLAJKY immunoprecipitations provádí na buňky transfektovaly s HKß sám, což dokazuje, že VLAJKA pAb není interakci s β-podjednotky (Obr. 2, HKß). Na HKß není coimmunoprecipitate s VLAJKOU pAb ze směsi (50:50, obj./obj.) lyzáty připravené z buněk transfektovaly jednotlivě s CD63-FL a β-podjednotky, které potvrzuje, že interakce se vyskytuje in vivo (Obr. 2, druhý pruh). Vzorky inkubovány s VLAJKOU pAb sraženina lysosomálního proteinu Lamp-1, což naznačuje, že interakce mezi CD63-FL a HKß je specifický a ne artefakt neúplné solubilizace v CD63 prostoru (Obr. 2).

poté jsme zkoumali, zda interakce mezi HKß a CD63 ovlivňuje subcelulární lokalizaci β-podjednotky. HKß je přítomen na povrchu buňky v přechodně transfekovaných COS buňkách (obr. 3 A-C). Existuje výrazná redistribuce β-podjednotky na intracelulární vezikuly obsahující CD63, když jsou COS buňky kotransfektovány jak HKß, tak CD63-FL (obr. 3 D-F). Vyloučit možnost, že tento změněný lokalizace může být nespecifický účinek zvýšená exprese CD63, jsme zkoumali vliv exprese CD63 na distribuci AQP4. AQP4 je vodní kanál, který je přítomen v bazolaterálních plazmatických membránách parietálních buněk. Nepodléhá regulované endocytóze a exocytóze S H,K-Atpázou (30, 31). Tento kanál nekoimunoprecipituje s CD63-FL v lyzátu Tritonu X-100 kotransfekovaných COS buněk (obr. 4A). Když jsou kotransfektované buňky vizualizovány imunofluorescenční konfokální mikroskopií, AQP4 není přítomen v kompartmentu obsahujícím CD63 (obr. 4B), což naznačuje, že redistribuce vyvolaná CD63 na intracelulární vezikuly je specifická pro proteiny, které interagují s tímto tetraspaninem.

zkoumat mechanismy CD63-zprostředkované přerozdělení HKß, využili jsme nedávné práce, které se vyznačují intracelulární obchodování CD63. Rous et al. (13) prokázalo, že motiv na bázi tyrosinu přítomný na extrémním konci C CD63 interaguje s adaptorovými podjednotkami μ2 a μ3. Protein μ2 je členem heterotetramerního komplexu AP-2. Tento komplex je přítomen v plazmatické membráně a odkazy cargo proteiny s clathrin kabát, zprostředkování jejich endocytózu (14). Protein μ3 je členem heterotetramerního komplexu AP-3. Tento komplex se podílí na lysozomálním cílení a Nachází se jak v trans-Golgiho síti, tak ve vezikulárním kompartmentu, který částečně kolokalizuje s endosomy (12). Když je motiv CD63 na bázi YEVM tyrosinu mutován na AEVM, CD63 není schopen interagovat ani s μ2, ani μ3 a je primárně exprimován na povrchu buňky (13). Když je hkß koexpresován s konstruktem CD63-aevm označeným vlajkou, CD63-AEVM i β-podjednotka jsou distribuovány na povrchu buňky (obr. 3 G–I). Intracelulární distribuce HKß je tedy ovlivněna signály obchodování vloženými do cytoplazmatického ocasu CD63.

Když YEVM sekvence v zadní části CD63 je mutovaná YEVI, upravený motiv nadále komunikovat s μ3 ale již společníci s μ2 (13). CD63-YEVI je lokalizované především do late endosomal–lysosomálního kompartmentu, s největší pravděpodobností, protože změněné tetraspanin bílkovin se pohybuje přímo do tohoto prostoru po jeho počátečním biosyntetické průchodu Golgiho (13). Malá populace CD63-YEVI, která dosáhne plazmatické membrány, vykazuje zhoršenou internalizaci, protože již nemůže interagovat s μ2 (13). Když HKß a FLAG-tagged CD63-YEVI postavit se coexpressed v COS buňkách, hodně z CD63-YEVI je lokalizován do late endosomal–lysosomální prostoru; nicméně, β-podjednotka zůstává na povrchu buňky a není šířen do intracelulárního prostoru (Obr. 3 J–L). Koimunoprecipitační analýza potvrzuje, že HKß se může spojit s CD63-YEVI a CD63-AEVM (data nejsou zobrazena). Tato data naznačují, že pro distribuci HKß do CD63-pozitivního intracelulárního kompartmentu musí tyto proteiny interagovat na povrchu buňky a být endocytovány jako komplex.

určit, zda HKß detekován v intracelulárních váčků odpovídá protein, který byl endocytosed z povrchu buněk jsme pozorovali internalizace β-podjednotky v přítomnosti a nepřítomnosti exogenní exprese CD63. COS buňky byly cotransfected s HKß a CD63-FL. Buňky byly poté ochlazeny na 4°C, aby se zastavila endocytóza a povrch byl označen hkß mAb. Značené buňky byly inkubovány při 37°C po dobu 40 minut, aby se endocytóza mohla obnovit. Po inkubaci byly buňky ochlazeny na 4°C a povrchově značeny Cy5-konjugovaným kozím anti-myším IgG. Buňky byly fixovány a inkubovány s anti-FLAG pAb a pak byly označeny obě fluorescein isothiokyanátem-konjugované kozí anti-myší IgG a rhodamine-konjugované kozí anti-králičí IgG. To znamená, že HKß, které zůstaly na povrchu byl vizualizován na Cy5 kanál, internalizované HKß byl vizualizován na fluorescein isothiokyanátem kanál, a CD63-FL byl vizualizován na rhodamine kanálu. Tato analýza prokázala, že internalizované β-podjednotky colocalizes s CD63, což naznačuje, že bazén HKß, že je colocalized s CD63 je odvozen prostřednictvím endocytóza z buněčné membrány (Obr. 5 E–H). Buňky, které nadměrně neexprimují CD63, vykazují po 40minutové inkubaci mnohem méně internalizovanou β-podjednotku (obr. 5 A–D).

quantitate internalizace HKß a ověřit dále, že HKß a CD63 spolupracovník na povrchu buněk, provedli jsme buňka-povrch biotinylation experimenty. V prvním experimentu, PROTOŽE buňky byly transfektovaly s β-podjednotka sama a biotinylated s biotin-SS-N-hydroxysuccinimide ester při 4°C. Duplicitní vzorky byly poté inkubovány při 37°C pro různé délky času, aby endocytóza pokračovat. Buňky byly vráceny až 4°C, a jedna deska z každý časový bod byl zbaven zbývajících buněk-povrch biotin působením na membrány-impermeant redukční činidlo, MesNa. Buňky byly lyzovány a inkubovány streptavidinovými perličkami. Proteiny spojené s streptavidin korálky byly odděleny SDS/PAGE, a membrány byly sondoval s HKß mAb (Obr. 6A). Frakce β-podjednotky na buněčném povrchu se významně nemění, jak probíhá internalizace 37°C. Po prvních 10 min, malý zlomek povrchu-označené HKß je izolován uvnitř buňky, a poměr povrchu k internalizovány HKß zůstává vysoká. Tyto údaje naznačují, že β-podjednotky, která není spojena s CD63 buď zjednodušuje velmi pomalu, nebo je internalized ale recyklovaného rychle zpět na povrch, podobně jako transferin receptor.

dále jsme se snažili charakterizovat chování HKß, které se spojuje s CD63. COS buňky byly cotransfected s HKß a CD63-FL. Buňky byly biotinylovány a zbaveny, jak je popsáno výše. K izolaci obyvatel HKß, která je spojena s CD63, buněčný lyzát byl inkubován s VLAJKOU pAb a bílkovin-konjugované agarózového korálky. Imunoprecipitovaný materiál byl eluován malým množstvím pufru obsahujícího 3% SDS, zředěn 30krát 1% Tritonem X-100 a inkubován streptavidinovými kuličkami. Proteiny, které byly spojeny se streptavidinovými perličkami, byly odděleny SDS / PAGE a zkoumány HKß mAb (obr. 6B). Pro buňky, které nebyly podrobeny odizolování protokolu, signál detekován v tomto Western blot představuje celkové množství povrchu-označené β-podjednotky spojené s CD63, včetně komplexů, které byly ještě v plazmatické membráně a komplexy, které byly promítnuty do váčků. U buněk, které byly vystaveny odizolování protokolu, signál představuje populace β-podjednotky spojené s CD63, že byl přítomen na povrchu buněk během biotinylation a následně internalizovány a chráněné před MesNa pásu.

Na 0 min časový bod, biotinylated HKß je snadno detekován v anti-FLAG immunoprecipitates z unstripped buňky, které prokazují, že HKß a CD63 jsou schopny asociace na povrchu buněk. Všechny biotinylované HKß získané v časovém bodě 0-min jsou citlivé na pás MesNa. Množství CD63-související, biotinylated β-podjednotky chráněny před MesNa činidla se zvyšuje, jsou buňky nechá inkubovat při 37°C. Ve skutečnosti, množství HKß, který je přítomen na povrchu a spojené s CD63 na 0 min je přibližně stejné jako množství HKß, která je spojena s CD63 a chráněné před stripping na 45 min. Tato zjištění naznačují, že β-podjednotka spojená s CD63 je internalizována a nevrací se na povrch buňky.