Abstrakt
HIV-1 transkripce je regulována CDK9/cyklin T1, který, na rozdíl od typické buněčného cyklu-dependentní kinázy, je upravena spojením s 7SK malé jaderné ribonuclear proteinový komplex (snRNP). Zatímco proteinové složky tohoto komplexu jsou dobře studovány, mechanismus tvorby komplexu stále není plně pochopen. Asociace CDK9 / cyklin T1 s 7SK snRNP je částečně regulována reverzibilní fosforylací CDK9. Zde jsme se prezentovat komplexní přezkum kináz a fosfatáz podílí CDK9 fosforylace a diskutovat o své roli v regulaci replikace HIV-1 a potenciál pro cílené pro vývoj léčiv. Navrhujeme novou cestu regulace transkripce HIV-1 prostřednictvím fosforylace CDK9 ser-90 CDK2 a DEFOSFORYLACE CDK9 ser-175 proteinovou fosfatázou-1.
1. Úvod
Kompletní eradikaci HIV-1 infekce vyžaduje nové přístupy k vyvolání integrované HIV-1 provirus, který není ovlivněn stávající antiretrovirální léky a který je oživení po ukončení antiretrovirové terapie . HIV-1 latence může být výsledkem několika faktorů, jako je nedostatek HIV-1 transkripční aktivátor proteinu (Tat) nebo buněčné transkripční aktivátory, transkripční interference s buněčnou promotéři, nepříznivé integrace stránkách, epigenetika, a pravděpodobně dalších faktorů . Tak, lepší pochopení mechanismů HIV-1 transkripční aktivace je důležité pro navrhování nových léčiv zaměřených na indukci i inhibici HIV-1 přepis. Zde bychom přezkoumat kináz a fosfatáz podílí na aktivaci CDK9/cyklin T1 a diskutovat, jak tyto enzymy mohou být potenciálně použity k inhibici nebo aktivaci HIV-1 pro vývoj budoucí terapeutické intervence pro léčbu HIV-1 infekce.
2. Aktivace HIV-1 Transkripční P-TEFb
HIV-1 přepis je aktivován HIV-1 Tat protein, který se váže k vyboulení TAR RNA vlásenky-struktura smyčka se nachází na 5′-konec všechny rodící HIV-1 přepisy, a rekruty CDK9/cyklin T1, složka pozitivní přepis prodloužení faktorem b (P-TEFb) v HIV-1 promotoru (podrobně přezkoumány v ; viz také obrázek v Obrázku 1). Během transkripce zahájení, TFIIH-spojené CDK7/cyklin H fosforyluje Ser-5 v 1YSPTSPS7 heptapeptid sekvence opakuje 52 krát v C-terminální domény (CTD) RNAPII . Ser-5 fosforylované RNAPII hromadí na 20-40 nukleotidů (nt) po proudu transkripce začátek stránky, částečně v důsledku opatření negativní působící faktor prodloužení komplexu, NELF, a DRB citlivosti vyvolávající komplex, DSIF . Nedávno bylo prokázáno, že CDK7 spojené s TFIIH fosforyluje také zbytky CTD Ser-7, které mohou vést k fosforylaci ser-2 P-TEFb . Nábor P-TEFb HIV-1 promotoru se nachází v U3-R-U5 oblasti 5′ LTR je usnadněno Tat, který se zaměřuje CDK9/cyklin T1 TAR RNA, kde cyklin T1 se váže na G-bohaté smyčce TAR RNA . Nábor CDK9/cyklin T1 podporuje transkripční elongace RNA polymerázy II (RNAPII), který jinak je pozastavena po syntéze TAR RNA . Uvolnění RNAPII z pauzy komplexem P-TEFb je doprovázeno omezením mRNA a ztrátou NELF . P-TEFb spouští prodloužení RNA polymerázy II (RNAPII) přepis do phosphorylating negativní faktor prodloužení (NELF), a DRB citlivosti vyvolávající komplex (DSIF/Spt4/Spt5), čímž se podpoří uvolnění NELF a také phosphorylating Ser-2 reziduí v RNAPII CTD (přezkoumána v ). Po disociaci NELF se DSIF stává pozitivním faktorem prodloužení a zvyšuje procesivitu RNAPII . Ačkoli P-TEFb cestuje s komplexem elongace, jeho aktivita CTD kinázy již není vyžadována, jakmile je komplex uvolněn z pauzy .
Schematické znázornění HIV-1 transkripční regulace pomocí CDK9 fosforylace a dephosphorylation. Obrázek zobrazuje síť faktorů hostitelských buněk interagujících s Tat, které ovlivňují fosforylaci CDK9. Šipky označují fosforylaci (fialová), defosforylaci (oranžová) a přechod komplexních P-TEF a transkripčních komplexů (Černá). CDK2 fosforyláty CDK9 ser-90. Chelátory železa snižují buněčnou aktivitu CDK2 / cyklin E a inhibují transkripci HIV-1(indikováno červenou čarou). CDK7 fosforyláty CDK9 Thr-186. Dephosphorylation Thr-186 o PPM1A nebo PP1 usnadňuje disociace CDK9/cyklin T1 z velké P-TEFb komplexní nábor a CDK9/cyklin T1 Tat nebo BRD4. BRD4 přednostně váže ser-175-fosforylovaný CDK9. Defosforylace ser-175 pomocí PP1 aktivuje aktivitu kinázy CDK9 a aktivuje transkripci HIV-1. Nábor CDK9/cyklin T1 Tat do TAR RNA vede k fosforylaci NELF, která disociuje a také fosforylace DSIF a RNAPII CTD Ser-2 zbytky, které je usnadněno CTD Ser-7 fosforylace. CDK7 jako součást TFIIH fosforyluje zbytky CTD Ser-5 a případně ser-7. CDK7 také fosforyluje CDK9 Thr-186 a udržuje fosforylaci CDK9 Thr-186 během prodloužení transkripce.
Vzhledem k významu P-TEFb, nařízení musí být zachována, aby bylo zajištěno správné funkce. Fosforylace a defosforylace specifických míst na CDK9 musí probíhat během procesu transkripce a musí být přísně kontrolována. Tento přehled se zaměřuje na regulaci CDK9 prostřednictvím fosforylačních modifikací.
3. Složení P-TEFb a Jeho Role v HIV-1 Transkripční Aktivace
P-TEFb je heterodimeru skládající se z cyklin-dependentní kinázy 9 (CDK9) a jeden z C-typu cyclins T1, T2a nebo T2b, které cyklin T1 je nejhojnější partnera . Cyklin K, který byl původně považován za menší cyklin CDK9, je nyní uznáván jako cyklinový partner pro CDK12 a CDK13 . Pouze protein cyklin T1 účinně tvoří komplex s HIV-1 Tat vázaným na TAR RNA . To je vzhledem k přítomnosti cysteinu v cyklin T1 na pozici 261 spíše než asparagin nalézt v cyklin T2a a T2b proteiny. Cyklin T1 s mutovaným Cys-261 se váže na Tat, ale není schopen rekrutovat Tat na TAR RNA. Interakce Tat s TAR RNA a cyklinem T1 je závislá na iontech zinku, což opět vyžaduje přítomnost Cys-261 .
Existují dva funkční izoformy CDK9: 42 kDa tvoří převážně vyjádřeny ve slezině, brzlíku, varlatech a 55 kDa formě, která je vyjádřena v různých tkáních, ale na výrazně nižší úrovně, které je 42 Kd izoformy . Všechny cykliny se sdružují s oběma izoformami CDK9 a vykazují kinázovou aktivitu vůči CTD v RNAPII . Zhruba polovina z P-TEFb je v neaktivním velký komplex vázán 7SK snRNA a několik dalších proteinů, včetně hexametylen bisacetamide-indukovatelných proteinů 1 (HEXIM1) , La-související LARP7 bílkovin , a methylphosphatase limitujícího enzymu MePCE . Forma P-TEFb s nižší molekulovou hmotností sestává z CDK9 a cyklinu T1 a je enzymaticky aktivní . Vysokomolekulární P-TEFb je neaktivní kvůli HEXIM1, který zavádí svou inhibiční pynt sekvenci do aktivního místa CDK9 .
vysoké molekulové hmotnosti P-TEFb komplex slouží jako zdroj CDK9/cyklin T1 pro nábor HIV-1 Tat . V stres-indukované buňky, CDK9/cyklin T1 komplex disociuje od 7 SK RNA/HEXIM1 bílkovin a pak se váže BRD4 a tvoří transkripčně aktivní malý komplex, který je naverbován na různé buněčné promotory . Navzdory nečinnosti velkého komplexu P-TEFb in vitro je velký komplex, a nikoli malý komplex, důležitý pro aktivaci transkripce HIV-1 jako HIV-1. Tat soutěží s HEXIM1 o vazbu na cyklin T1 podporující disociaci P-TEFb z velkého komplexu . Bylo také prokázáno, že HIV-1 Tat protein rekrutuje velký komplex P-TEFb na promotor HIV-1, Kde TAR RNA byla schopna vytěsnit 7 SK RNA a aktivovat P-TEFb .
Tat také usnadňuje tvorbu super prodloužení komplexu (SEC) obsahující aktivní P-TEFb a další prodloužení faktory a transkripce coactivators . Mezi tyto faktory patří AFF4, ENL, AF9 a elongační faktor ELL2 . Protein AFF4 se objevuje jako centrální lešení, které přijímá další faktory prostřednictvím přímých interakcí. AFF4 váže cyklin T1, ELL2 a ENL nebo AF9 jako most, který spojuje tento komplex S P-TEFb . Prostřednictvím překlenovacích funkcí Tat a AFF4 se p-TEFb a ELL2 spojí a vytvoří bifunkční komplex elongace, který výrazně aktivuje transkripci HIV-1 . Bez Tat může AFF4 zprostředkovat interakci ELL2-P-TEFb, i když neefektivně. Tat překonává toto omezení tím, že přináší více ELL2 na P-TEFb a stabilizuje ELL2 v procesu, který vyžaduje aktivní P-TEFb .
4. CDK9 Fosforylace
Aktivity P-TEFb je závislá na fosforylaci několika serin a threonin reziduí a budeme diskutovat o tom níže, a které jsou uvedeny v CDK9/cyklin T1/Tat model na Obrázku 2.
Struktura CDK9/cyklin T1/Tat komplex (model založený na PDB 3MIA). Páteřní reprezentace zbytků CDK9 přítomných v původní struktuře PDB je zobrazena v zelené barvě, cyklin T1-ve fialové a Tat-v červené barvě. Je indikována Poloha clusteru Thr-29, ser-175, Thr-186 A C-terminálu ser/Thr. Dále jsou uvedeny ATP-vazebné místo a ionty zn, které usnadňují interakci Tat-cyklin T1.
4.1. C-Terminální CDK9 Fosforylace
shluk CDK9 je C-terminální zbytky (Ser-347, Ser-353, a Ser-357; Thr-350 a Thr-354) je autophosphorylated a tato fosforylace je důležitá pro vazbu CDK9/cyklin T1 TAR RNA . To bylo doloženo neschopností enzymaticky aktivní C-terminálně zkrácené CDK9 vázat TAR RNA . Rekombinantní CDK9/cyklin T1, který byl autophosphorylated in vitro byla efektivně dephoshorylated pomocí proteinové fosfatázy 2A (pb 2a), ale ne protein fosfatázy-1 (PP1) . Také léčba PP2A zabránila vazbě CDK9 / cyklinu T1 na Tat a TAR RNA in vitro . Tato pozorování naznačují, že PP2A může cílit na C-konec CDK9 a potenciálně kontrolovat interakci P-TEFb s TAR RNA. Autofosforylace CDK9 spojená s preiniciačním komplexem in vitro byla inhibována TFIIH . Pb 2a, přičemž bylo později zjištěno, že je nezbytná pro bazální HIV-1, transkripce in vitro, jako pb 2a, přičemž vyčerpání inhibuje bazální HIV-1 transkripce a přidat zpět na pb 2a, přičemž do ochuzeného extraktů obnovena transkripce . Cíl PP2A byl považován za Thr-29 (viz níže), ale to nebylo s jistotou prokázáno a účinek nebyl reprodukován in vivo. V rané studii, Pozorovali jsme mírnou indukci bazální, ale ne Tat-indukované transkripce HIV-1 pomocí PP2A inhibujících nízkých koncentrací kyseliny okadaové . Jsme také pozorována indukce bazální a ne Tat-aktivován HIV-1 přepis s nadměrnou expresí LIS1 protein, který jsme našli vázat a inhibovat pb 2a, přičemž in vitro a komunikovat s HIV-1 Tat protein . Souhrnně tyto studie naznačují, že PP2A může regulovat bazální transkripci HIV-1 a také řídit interakci P-TEFb s TAR RNA defosforylací C-konce CDK9.
4.2. N-terminální thr-29 fosforylace
fosforylace CDK9 Thr-29 byla indukována HTLV-1 Tax proteinem . CDK9 / cyklin T1 se rekrutuje do CHROMATINIZOVANÉ HIV-1 LTR a dalších promotorů pomocí BRD4 . Tento nábor BRD4 byl spojen s fosforylací CDK9 Thr-29 a požadavkem na DEFOSFORYLACI PP2A skupinou Johna Bradyho . Nicméně, Zhou Qiang je skupina oznámila, že CDK9 je potřeba být fosforylován na Ser-175 vázat se na BRD4 , který byl nedávno potvrzen Jonathan Karn skupiny (viz podrobná diskuse níže). Cdk9 Thr-29 je homologní s Thr-15 na CDK2, ve kterém fosforylace inhibuje aktivitu CDK2 . Ukázalo se, že fosforylace Thr-29 inhibuje aktivitu CDK9 a transkripci HIV-1 . Nicméně, jsme se nepodařilo zjistit CDK9 Thr-29 fosforylace v buňkách léčených okadaové, že inhiboval pb 2a, přičemž a PP1 pomocí kombinace Hunter 2D tenkou vrstvu elektroforézy a hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením, který jen ukázal, fosforylace C-terminální Ser/Thr Ser clusteru a-175, z nichž pouze Ser-175 fosforylace byla vyvolána tím, že okadaové . Fosforylace CDK9 Thr-29 tedy nemusí být kontrolována PP2A a musí být dále validována, aby se objasnila její role během transkripce HIV-1.
4.3. CDK9 je T-Smyčka Thr-186 Fosforylace
CDK9 T smyčka obsahuje několik fosforylace míst, včetně Ser-175 a Thr-186 (Obrázek 2). Fosforylace konzervovaného Thr-186 je nezbytná pro enzymatickou aktivitu CDK9 . Také asociace CDK9 / cyklinu T1 s 7SK RNA snRNP vyžaduje fosforylaci THR-186 CDK9. V CDKs, fosforylace T-smyčka spouští hlavní konformační změny, které otevřete ATP vazebné kapsy a substrát vazebné místo aby CDKs plně aktivní jako kinázy .
v Poslední době, chemicko-genetická analýza pomocí selektivní chemické inhibice CDK7 ukázala, že je výhradně odpovědný za CDK9 Thr-186 fosforylace a pro P-TEFb-závislé CTD Ser-2 fosforylaci a histonu H2B ubiquitylation in vivo . Tak, CDK7/cyklin H, který byl dříve identifikován jako CDK-aktivační kinázu (CAK) pro CDKs zapojené do buněčného cyklu, jako jsou CDK1, 2, a 4 funguje také jako CAK pro CDKs podílející se na regulaci transkripce, které zahrnují CDK8, 9, 12, a 13 (přezkoumána v ). Globální analýza kináz, které mohou fosforylovat CDK9 T-smyčky pomocí siRNA zjištěné Ca(2+)/kalmodulin-dependentní kinázy 1D (CaMK1D) srazit dolů pomocí siRNA snížil Thr-186 fosforylace . Proto, malé molekuly inhibice Ca(2+) signální dráhy snížil Thr-186 fosforylace a inhibuje Tat-vyvolané HIV-1 přepis, ale ne Daň-zprostředkované HTLV-1 přepis . Protože transkripce zprostředkovaná daní je řízena P-TEFb, zbývá dále zkoumat, proč byla ovlivněna pouze transkripce HIV-1.
cdk9 Thr-186 fosforylace může být také řízena buněčnými fosfatázami. Naše studie za poslední desetiletí se zaměřily na PP1, které jsme zpočátku pozorovali, že stimulují transkripci HIV-1 závislou na Tat in vitro . Když jsme nadměrně exprimován jedním z hlavních jaderných regulačních podjednotek PP1, NIPP1 (jaderné inhibitor PP1), jsme pozorovali PP1-specifické inhibice HIV-1 virové transkripce a replikace . Všimli jsme si, že Tat obsahuje sekvenci, která je podobná zachovány PP1-závazné RVxF motivem a ukázal, že tento motiv zprostředkovává Tat vazba na PP1 in vitro a in vivo a že mutace reziduí v PP1 binding motif (V36A a F38A) zabránit Tat z indukovat HIV-1 přepis . CDK9, který byl fosforylován v kultivované buňky označeny (32P)disodného a zacházet s okadaové byl efektivně dephophosphorylated in vitro tím, že PP1 ale ne pb 2a, přičemž na rozdíl od in vitro autophosphorylated CDK9, která byla defosforylována tím, pb 2a, a ne tím, PP1 . Tyto výsledky naznačují, že PP1 může kontrolovat fosforylaci CDK9 během transkripce HIV-1. Opravdu, alfa katalytickou podjednotku PP1, PP1a, bylo prokázáno, jednat kooperativně a postupně s (Ca2+)-kalmodulin-protein fosfatázy 2B (PP2B) v UV ozáření nebo hexametylen bisacetamide (HMBA) ošetřených buněk, v nichž P-TEFb je propuštěn z 7SK snRNP komplexu . Zatímco PP2B indukuje konformační změnu v 7SK snRNP, PP1a dephosphorylates CDK9 Thr-186 a usnadňuje uvolnění P-TEFb z 7SK snRNP . CDK9 zůstal defosforylován, zatímco byl spojen s BRD4 a byl rekrutován do preiniciačního komplexu, kde může být reaktivován CDK7 spojeným s TFIIH. Podle této studie, jsme pozorovali zvýšenou CDK9 Thr-186 fosforylace v buňkách, které stabilně vyjádřil PP1-inhibiční peptid, centrální doména NIPP1, a také pozorována zvýšená asociace CDK9/cyklin T1 s 7SK RNA . Stabilní exprese cdNIPP1 narušena interakce mezi Tat a PP1 a inhibuje HIV-1 přepis , což naznačuje, že rovnováha musí být zachována mezi fosforylací a dephosphorylation z CDK9 Thr-186, a že posunutí této rovnováhy směrem k fosforylace je inhibiční pro HIV-1 přepis. Vyjádření cdNIPP1 ve fyziologicky relevantním způsobem jako součást HIV-1 genomu v místě nef silně inhibována replikace HIV-1 , dále naznačuje, že PP1-cílené inhibitory může být použití jako potenciální anti-HIV-1 therapeutics. Zatímco PP1 je kandidátem na Defosforylaci Thr-186, zjistili jsme také, že defosforyluje CDK9 ser-175 (viz níže). Další cdk9 Thr-186 fosfatáza, protein fosfatáza 1A závislá na hořčíku (dříve 2C) (PPM1A) byla identifikována pomocí knihovny exprese fosfatázy a thr-186-fosfospecifických protilátek . PPM1A zvýšená exprese snížená Thr-186 fosforylace a siRNA-zprostředkované vyčerpání zvýšil, a P-TEFb a PPM1A také coprecipitated dohromady, což naznačuje, že CDK9 může být fyziologický substrát pro PPM1A . Další nedávná studie ukázala, že CDK9 je Thr-186 fosforylace je snížena v klidových CD4(+) T buněk, které jsou non tolerantní pro replikace HIV-1 a že tento pokles koreluje s množstvím PPM1A a omezený nábor CDK9 velké P-TEFb komplexu . Toto zjištění dále podporuje nutnost velkého komplexu pro transkripci HIV-1 a kritickou roli PPM1A v supresi HIV-1 v klidových T buňkách. Protože exprese PPM1A nebyla po aktivaci T buněk změněna, mohou být do regulace aktivity PPM1A zapojeny dosud neznámé regulační faktory.
4.4. Fosforylace t-smyčky CDK9 ser-175
jakmile se CDK9 / cyklin T1 disociuje od velkého komplexu P-TEFb, CDK9 se může fosforylovat na ser-175. Zatímco Thr-186 dephosphorylation zcela inhibována CDK9/cyklin T1 kinázy, nebyl zjištěn žádný rozdíl v kinázy činnosti CDK9 S175A a CDK9 S175D mutanti David Cena a kolegy . Naproti tomu Qiang Zhou a jeho skupina ukázali, že mutant CDK9 S175A byl neaktivní, zatímco mutant CDK9 s175d byl aktivní jako kináza . Rovněž ukázaly, že fosforylace Ser-175 podporuje vazbu CDK9 / cyklinu T1 na Brd4 . Bylo navrženo, že fosforylace Ser-175 může způsobit konformační změnu CDK9, což umožňuje BRD4 vázat se na cyklin T1 . V naší nedávné studii jsme zjistili, že dynamické inhibici PP1 vedl k exkluzivním fosforylace CDK9 Ser-175 určena kombinací Hunter 2D peptidové mapování a LC-MS analýzu in vivo . Inhibice PP1 vedla k inhibici aktivity CDK9 a snížení fosforylace RNAPII in vitro a in vivo . Zjistili jsme, že mutant CDK9 S175A byl enzymaticky aktivní a indukoval transkripci HIV-1 . Zajímavé je, že zatímco mutant CDK9 S175D byl méně aktivní jako kináza, snadněji tvořil malý komplex P-TEFb, zejména když byl inhibován PP1. Dospěli jsme tedy k závěru, že PP1 aktivuje transkripci HIV-1 defosforylací zbytku CDK9 Ser-175. Také jsme si všimli, že Ser-175 fosforylace aktivita byla mnohem hojnější než Thr-186 aktivita v buněčných extraktů, což naznačuje, že CDK9 aktivita může být přirozeně potlačen prostřednictvím overphosphorylation Ser-175. Nedávná studie skupiny Jonathana Karna ukázala, že aktivace T buněk prostřednictvím receptoru T-buněk (TCR) nebo Ester forbolu (PMA) signalizující silně indukovanou fosforylaci CDK9 Ser-175 . Na základě molekulární modelování navrhli, že fosforylované Ser-175 tvoří vodíkové vazby s Tat Lys-14 posílení vazby Tat k CDK9/cyklin T1 a podporu HIV-1 transkripční aktivaci . Také v souladu s časnými pozorováními bylo zjištěno, že mutace CDK9 S175A ruší vazbu na BRD4 . Také, v souladu s našimi pozorováními, CDK9 S175A mutantů bylo zjištěno, že výrazně vyvolat Tat-závislé latentního HIV-1 reaktivaci, které Jonathan Karn a jeho spolupracovníci přičíst neschopnosti tento mutant vázat BRD4, přičemž je schopen se vázat na Tat . Také zjistili, že CDK9 fosforylován na Ser-175 je vyloučen z 7SK RNP komplexu , který paralely naše dřívější pozorování, že CDK9 S175D phosphomimetic mutant byl nalezen v malé P-TEFb komplexu . Tato nejnovější studie tedy poukazuje na Ser-175 jako důležitý cíl pro reaktivaci HIV-1 a potenciální vývoj terapeutik s malými molekulami.
nedávno jsme vyvinuli malé molekuly zaměřené na PP1, které byly modelovány tak, aby se vešly do dutiny přizpůsobující RVxF na PP1 . Screening jsme prakticky asi 300 000 sloučenin a pak fyzicky promítán přibližně 1000 sloučenin a identifikován jeden hit sloučenina, 1H4, který inhibuje HIV-1 transkripce a replikace na noncytotoxic koncentrace . 1H4 zabránit PP1-zprostředkované dephosphorylation substrátu peptid obsahující RVxF sekvence in vitro, narušení asociace PP1 s Tat v kultivované buňky, a brání translokaci PP1 do jádra . V současné době jsme v procesu rafinace hit sloučeniny a také rozvoj PP1-cílené sloučenin pro aktivaci latentní provirus.
4.5. Fosforylace CDK9 ser-90
my a další jsme dříve ukázali, že transkripce HIV-1 je aktivována Tat ve fázi G1, ale ne ve fázi G2 . Předpokládali jsme tedy, že Tat může zapojit regulační kinázu buněčného cyklu, což se ukázalo jako CDK2 / cyklin E . HIV-1 je inhibována v CDK2 povalení buněk a také v makrofázích odlišení od indukovaných pluripotentních kmenových buněk s CDK2 poražený , dále, což naznačuje, že CDK2 je důležité pro HIV-1 transkripce a replikace. Funkční spojení mezi CDK2 a CDK9 bylo zjištěno, když jsme analyzovali inhibici HIV-1 chelátory železa. Transkripce HIV-1 byla inhibována v T buňkách léčených chelátory železa 311 a ICL670, které také inhibovaly buněčnou aktivitu CDK2 a CDK9 . Silnější di-2-pyridylketone thiosemicarbazone na bázi trojzubý chelátory železa inhibuje HIV-1 transkripce a replikace viru v mnohem nižších koncentracích než 311 nebo ILC670 a také inhibuje CDK2 a CDK9 činnosti . Zatímco mechanismus inhibice CDK2 není dosud objasněna, je pravděpodobně zahrnovat indukci p21 prostřednictvím upregulace hypoxií-indukovaný faktor 1 (HIF-1) jako železo vyčerpání odstraňuje železo z prolyl hydroxylázy a zvyšuje HIF-1 a HIF-2 množství bílkoviny napodobující účinek hypoxie . Analyzovali jsme CDK9 fosforylace pomocí CDK2 in vitro a identifikovala motiv (90SPYNR94), který představuje konsensus CDK2 fosforylace stránky a který byl účinně fosforylován . Fosforylace CDK9 na Ser-90 byla detekována fosfospecifickými protilátkami a po vyřazení CDK2 byla snížena. Asociace mutantů CDK9 S90A s velkým komplexem P-TEFb byla snížena a jeho nadměrná exprese inhibovala transkripci HIV-1. V kontrastu, CDK9 S90D mutant ukázal beze změny asociace s velkými a malými P-TEFb komplexy a vyvolané Tat-závislé HIV-1 přepis. Fosfomimetický S90 však vykazoval celkové snížení exprese CDK9, což naznačuje, že musí být zachována rovnováha fosforylace / defosforylace, aby se vytvořily velké a malé komplexy P-TEFb. Molekulární modelování ukázalo, že Ser-90 CDK9 byla umístěna na flexibilní smyčky vystaveny rozpouštědla, což naznačuje, že by to mohlo být podstupují fosforylaci (také je vidět na Obrázku 2). Naše nedávné studie tedy identifikovaly nové regulační fosforylační místo na CDK9, které může být zaměřeno na aktivaci nebo inhibici transkripce HIV-1.
5. Závěr
Fosforylace a dephosphorylation specifických míst na CDK9 se vyskytuje v celém procesu transkripce a musí být přísně kontrolována. Změny v určitých threonin/serinové zbytky určit, zda CDK9 společníci s velkým P-TEFb složité, aby se stal k dispozici pro nábor a zda disociace velký komplex bude efektivně dojít. Fosforylace Thr-186 v T-smyčky CDK9 a Ser-90, které leží mimo T-loop určuje, zda CDK9 zůstává izolován v neaktivní velký komplex a také, zda kinázy je enzymaticky aktivní, jakmile je oddělena od 7SK snRNP. Dephosphorylation ani na jednom z těchto míst vede k destabilizaci velký komplex a uvolnění CDK9/Cyklin T1, čímž se omezuje Tat náboru HIV-1 LTR. Modifikace v C-konci CDK9 umožňují cyklin T1: vazba dehtu a defosforylace na těchto místech brání vazbě na RNA. Naproti tomu fosforylace při zbytcích Thr-29 nebo ser-175 inhibuje CDK9. Vznikající obraz regulace CDK9 prostřednictvím fosforylace se tedy zdá být složitý a částečně se vyrovná tomu, co je známo pro jiné CDK. Nedávno zjištěné CDK9-cílené kináz, CDK7, CDK2, a fosfatáz, PP1, a PPM1A bude pravděpodobně objeví jako nové cíle pro anti-HIV-1 a cancer therapeutics.
střet zájmů
autoři prohlašují, že neexistuje žádný střet zájmů ohledně zveřejnění tohoto příspěvku.
Poděkování
Tento projekt byl podpořen District of Columbia Vývojové Centrum pro Výzkum AIDS (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 z Výzkumného Centra v Menšinových Institucí (RCMI) Programu (Oddělení pro Výzkumné Infrastruktury, Národní Centrum pro Výzkum Zdrojů, NIH), ruské Nadace pro Základní Výzkum (ne. 12-04-91444-NIZ) a ruské Ministerstvo Školství a Vědy (ne. 2012-1.5-12-000-1001-030). Autoři by také chtěli poděkovat členům Nekhai lab za návrhy a omluvit se za ty, jejichž práce nebyla citována kvůli nedostatku místa.
