Abstrakt

Napětí-gated L-typ Cav1.2 kalciových kanálů pár depolarizace k přechodnému zvýšení cytoplazmatické zdarma Ca2+ koncentrace, která iniciuje řadu základních buněčných funkcí, včetně srdeční a cévní, svalové kontrakce, genové exprese neuronální plasticity, a exocytóza. Inaktivace nebo spontánní ukončení proudu vápníku přes Cav1. 2 je kritickým krokem v regulaci těchto procesů. Patofyziologický význam tohoto procesu se projevuje hypertenzí, srdečním selháním, arytmií a řadou dalších onemocnění, kde by zrychlení rozpadu vápníku mělo představovat prospěšnou funkci. Ústředním tématem tohoto článku je inaktivace kalciového kanálu Cav1. 2 zprostředkovaná více determinanty.

1. Úvod

napětí-gated dovnitř Ca2+ proud () je společný mechanismus přechodné zvýšení cytoplazmatické zdarma koncentrace Ca2+ vyvolané buněk depolarizace. Tato forma signalizace Ca2+ aktivuje základní buněčné procesy včetně srdeční kontrakce, regulace tónu hladkého svalstva, genové exprese, synaptické plasticity a exocytózy . Kompletní a rychlé ukončení Ca2+ influx je zprostředkován složitý mechanismus samovolné inaktivaci vápníkových kanálů, což má zásadní význam pro prevenci Ca2+ přetížení buňky během akčního potenciálu a obnovení klidového sub-µM cytoplazmatické zdarma Ca2+ koncentrace . Tento článek se zaměří na molekulární bázi a více determinantů inaktivace kalciového kanálu Cav1.2.

2. Cav1. 2: výzvy a řešení

2.1. Molekulární složitost

kalciový kanál Cav1.2 je oligomerní komplex složený z podjednotek A1C, α2δ a β . Pór iontového kanálu je tvořen peptidem A1C (Obrázek 1), který je kódován genem CACNA1C. Pomocné podjednotky β a α2δ jsou nezbytné pro funkční expresi a cílení plazmatické membrány (PM) kanálu . Existují ve více genomických izoformách generovaných čtyřmi geny CACNB (CACNB1-4) a třemi geny CACNA2D (CACNA2D1-3). Všechny tři podjednotky podléhají alternativnímu sestřihu. Přidání ke složitosti molekulární organizace Cav1.2, β podjednotky mají tendenci oligomerizovat . Všichni společně, genomová variabilita, alternativní sestřih, a hetero-oligomerization generovat nepřeberné množství Cav1.2 splice varianty, které jsou exprimovány v buňkách živočichů-tkáně-, a vývojovým způsobem závislým, zatímco změna jejich křehká rovnováha může mít významné patofyziologické důsledky .

Obrázek 1

Transmembránové topologie α 1C podjednotky. Pro ilustraci stránek molekulární rozmanitost, polypeptidové sekvence je schematicky segmentované podle CACNA1C genomické mapy a odpovídající invariantní (černá) a alternativní (modrá) exons jsou uvedeny černými pruhy a číslem (1-50). Předpokládá se, že čtyři oblasti homologie (I-IV), každá složená ze 6 transmembránových segmentů (očíslovaných), jsou složeny kolem centrálního póru. α-interakční doména (AID) konstitutivního β-vazebného místa je zobrazena zeleně. LA a IQ motivy (červené) tvoří doménu vázající kalmodulin (CBD).

2.2. Problémy při Výběru Hostitelské Buňky

Přirozeně se vyskytující rozmanitost Cav1.2 komplikuje interpretaci údajů získaných od rodilých buňky, natož jeden kanál údajů. To je základem významu Cav1.2 výzkum v rekombinantní expresní systémy, kde molekulární složení kanál a struktura jeho složky jsou předem definované. Tento experimentální přístup se však setkal s hlavním problémem výběru vhodné hostitelské buňky.

většina studií vápníkových kanálů byla provedena za použití buněk HEK293. Tyto buňky poskytují vysokou účinnost exprese rekombinantních kanálů Ca2+, ale bohužel obsahují endogenní kalciové kanály vykazující proudy Ca2+ až do 3 pA/pF . Buňky HEK293 tedy umožňují adekvátní studium rekombinantních kanálů Ca2+ pouze tehdy, když je amplituda proudu dostatečně velká, aby ignorovala příspěvek endogenních kanálů. Správné posouzení funkčních determinantů kanálů Ca2+ však vyžaduje použití hostitelských buněk, které jsou zcela prosté endogenních podjednotek kanálů Ca2+. COS1 nebo COS7 buňky vyhovoval tomuto požadavku dobře, protože se nevytváří žádný znatelný vápníku aktuální, neobsahují endogenní Ca2+ kanál podjednotek nebo jejich prekurzorů, a nevykazují žádné indukci endogenní Cav1.2 podjednotek v reakci na vyjádření rekombinantní ty . Kinetika parametrů a napětí závislost aktivace a inaktivace Cav1.2 kanál proudy naměřené v COS1 buňky jsou v souladu s údaji získanými v jiných expresní systémy . Důležitou výhodou COS buněk je jejich relativně pomalá rychlost dělení, která umožňuje lepší kontrolu nad efektivitou exprese a sestavení podjednotek kanálu Cav1. 2 různé velikosti.

2.3. Problémy Fluorescenční Značení a Měření

Fúze GFP-jako fluorophores na N – nebo C-termini rekombinantní a1C nebo na N-konci β nemá výrazně změnit elektrofyziologické vlastnosti vyjádřené programy, umožňuje použití zářivek a FRET (fluorescent resonance energy transfer) mikroskopie pro studium subcelulární distribuci a montáž Cav1.2, jakož i složité aspekty molekulární architektury a dynamiky kanálu. Kanál zachovává hlavní elektrofyziologické vlastnosti beze změny, když a1C C-terminální sekvence kódovány distální části exons 46-50 bodů (Obrázek 1, zbytků 1833-2138 v a1C,77) se nahrazuje tímto ECFP. Nicméně, a1C tavený jeho N – nebo C-termini na EYFP je vysoce citlivý na foto, které nevratně inaktivuje. Známý jako fluorophore-assisted světlo inaktivace (FALI), to je zajímavá vlastnost omezuje použitelnost akceptor foto pro měření FRET v Cav1.2 z důvodu nejistoty ve funkčním stavu kanálu . Nicméně, ratiometric analýza opraveny FRET mezi fluorophores, splynula s ocasy a1C a/nebo β podjednotek, odráží reverzibilní stav-závislé strukturální přestavby kanálu vyvolané změny transmembránové napětí pod patch clamp .

2.4. Rekombinantní Cav1. 2: Co potřebuje pro funkční expresi a jak se zdá?

typické vlastnosti rekombinantního Cav1. 2 „divokého typu“ jsou znázorněny na obrázku 2(A)na příkladu všudypřítomné lidské izoformy A1C, 77 (GenBank no. z34815). Když EYFP-označené a1C byl vyjádřen v COS1 buňky sám, fluorescenční-tagged kanál protein byl difúzně distribuovány v průběhu cytoplazmě a ne generovat měřitelné vápníku proudu (Obrázek 2(A), panel a). Kvantitativní analýza distribuce a1C mezi PM a cytoplazmě (Obrázek 2(B)) potvrdil, nedostatek významné PM cílení podle a1C nezávisle na přítomnosti α2δ (bary a a b). Vyjádření Cavß v nepřítomnosti α2δ stimulovány PM cílení a1C, ale kanál mlčel (Obrázek 2(A), panel c), pokud α2δ byl coexpressed (panel d). Tak, β a α2δ podjednotky jsou dostatečné pro funkční kanál; za těchto experimentálních podmínek, β podjednotky stimulují PM cílení kanálu složitý, a v přítomnosti α2δ, usnadnit napětí vtokové z Cav1.2 kanál.

Obrázek 2

Role Cav1.2 pomocné podjednotky. (A) Epifluorescent obrazy vyjadřující COS1 buněk ukazuje rozložení EYFPN-α 1C získané s YFP filtr (škálování bary, 4 µm) a stopy maximální vápníku aktuální zaznamenány v reakci na 600 ms. kroky na +30 mV od držení potenciál mV (vlevo). (B) Relativní distribuce EYFPN-α 1C v plazmatické membráně (PM) v cytoplazmě v nepřítomnosti (a) nebo přítomnost 2δ α (b), β 2d (c), nebo 2δ α + β 2d (d). Poměr intenzity fluorescence v PM nad oblastí pod PM byl zprůměrován po odečtení pozadí v každé buňce. Poměr menší než 1.0 označuje nedostatek významného cílení PM pomocí α 1C.*.

tvar a vzhled vrcholu vápníku aktuální znázorněno na Obrázku 2(A) (panel d) je docela typické pro beta2-modulovaný Cav1.2 . Mezi jeho hlavní rysy patří relativně pomalá rychlost rozpadu a velká část trvalého zbývajícího konce depolarizačního pulsu . Je zřejmé, že během dlouhodobých akčních potenciálů mohou tyto vlastnosti vést k patogennímu přetížení buňky vápníkem, pokud není vyvážena robustními kompenzačními mechanismy. Byla to konečná role Cav1.2 vymezení trvání akčního potenciálu srdeční buňky, které vyvolalo výzkum a vývoj blokátorů kalciového kanálu, třída léků, které teď má miliardový trh. Právě tato role Cav1. 2 stimuluje současný zájem o identifikaci molekulárních determinantů inaktivace Cav1.2 v naději na nalezení konkrétnějších a účinnějších léků.

2.5. Poslední, ale v neposlední řadě Komplikace: Cav1.2 Clustering

jeden ventrikulárních myocytů obsahuje ~300,000 Cav1.2 kanály, ale pouze ~3% kanály jsou otevřené na vrcholu . Na rozdíl od všeobecného přesvědčení, Cav1.2 kanály nejsou rovnoměrně rozloženy přes plazmatickou membránu. V nativních neuronálních a srdečních svalových buňkách tvoří velké shluky. Single-molecule imaging funkční rekombinantní EYFPN-a1C/ß2a/α2δ programy vyjádřené v HEK293 buněk odhalilo shluky složené z ~40 kanálů, které jsou mobilní v plazmatické membráně . Oba fluorescenční korelační spektroskopie a fluorescence recovery after foto experimenty přinesly laterální difúzní konstanta µm2/s. Funkční význam Cav1.2 shluky mobility, není jasné. Předpokládá se, že v buňkách srdečního svalu může být tato pohyblivost omezena interakcemi s jinými proteiny, například ryanodinovými receptory . Velikost klastrů Cav1.2 a jejich specifická hustota v plazmatické membráně závisí na typu vyjádřené β podjednotky . Vzdálenost mezi terminy sousedních podjednotek A1C se pohybuje od 67 Å s neuronálním / srdečním ß1b do 79 Å s vaskulárním β3. Nejvyšší hustotu Cav1.2 klastrů v plazmatické membráně a nejmenší velikost clusteru byly pozorovány s ß1b dárek. Pohled na molekulární mechanismy určující strukturu a vlastnosti Cav1.2 klastrů je důležité pro lepší pochopení patofyziologie spojky mezi Cav1.2 činnost a indukované reakce v Ca2+ signální transdukce.

3. Napěťově a Ca2+závislá inaktivace kalciového kanálu Cav1. 2

v případě kalciových kanálů Cav1.2 jsou dva různé mechanismy pod kontrolou inaktivace proudu Ca2+. Jeden mechanismus je poháněn ionty Ca2+ na cytoplazmatické straně plazmatické membrány, zatímco druhý závisí na transmembránovém napětí. Experimentálně, nahrazení Ca2 + pro Ba2 + jako nosič náboje eliminuje inaktivaci závislou na Ca2+(CDI), takže kalciové kanály vodivé Ba2+inaktivují způsobem závislým na napětí pomocí rychlých (FI) a pomalých (SI) mechanismů . Tyto tři mechanismy inaktivace, FI, SI a CDI, a jejich hlavní determinanty jsou znázorněny na obrázku 3.

Obrázek 3

Molekulární determinanty Cav1.2 inaktivaci. Srovnání divokého typu Cav1.2 (A) se stejným kanálem zbaveným determinantů CDI (B) a SI (C). Pět vodorovných panelů ukazuje (a) uspořádání kritických determinantů inaktivace. ADSI se skládá z konzervovaných hydrofobních aminokyselin v poloze -2 segmentů S6 v opakováních II ,III a IV (žluté kruhy: Ala, Val a Ile, resp.) stejně jako zbytek Ser v -1 pozici IS6 (azurová kružnice). Doména vázající CaM (CBD) ocasu α 1C C je znázorněna červeným zaobleným obdélníkem. Β podjednotky (zelená) se váže na α-interakce domény v linker mezi opakuje i a II, a, v Ca2+-závislým způsobem, IQ-oblast α 1C podjednotky C-tail (není uvedeno). Distální struktura β 2 (β 2, modrá koule) se váže na CBD . b) důkaz koimunoprecipitace uvedených podjednotek. (c) Normalizované stopy (černá) a (červené), a (d) napětí závislost (červená) a časovou konstantu FI (černá) jsou prezentovány pro ilustraci CDI v (a) a nedostatek CDI v (B) a (C). e) souvislost mezi CDI a diferenciální modulací β-podjednotky (DßM) Cav1. 2. A) diferenciální modulace inaktivace β 1a (Černá stopa) a β 2a (zelená Stopa) ve WT Cav1. 2. Narušení CBD (α 1C, 86)eliminuje CDI a SI cílené CDI a DßM (B). Mutace ADSI (α 1C, IS-IV)odstranila CDI a plně inhibovala SI, takže kanál zůstává vodivý po dobu trvání depolarizačního stimulu (C).

3.1. Ca2+-Závislé Inaktivace a Kalmodulin-Vazebné Domény a1C

Existuje několik různých faktorů CDI, ale to nebylo až do roku 1997, že Ca2+-snímání stránky z CDI byl zúžen na úsek z 80 aminokyselin C-terminální sekvence a1C kódovány exons 40-42 (Obrázek 2) označena červenou blok na Obrázku 3(A) (panel). Přirozeně se vyskytující spojovat rozdíly v této oblasti v a1C,86 (Obrázek 3(B)) zcela inhibována CDI, jak je zřejmé z nedostatku zpomalení proudu s Ba2+, protože nosiče náboje (panel c, černá stopa) ve srovnání s (červená stopa). Dalším charakteristickým rysem inhibována CDI byl nedostatek aktuální velikost, závislost na napětí (viz Obrázek 3(B), panel d, otevřené symboly), které zůstává na rozdíl od U-tvaru závislost časové konstanty rychlého inaktivace () na membránový potenciál v wild-type Cav1.2 (viz Obrázek 3(A), panel d). Dvě odlišné sekvence, L a K, byly identifikovány v rámci této 80-amino-kyseliny úsek, jehož a1C,86-jako mutace v přírodě-typ a1C splňovat stejné charakteristické rysy , což naznačuje existenci dvou sousedních CDI senzory. Jeden z nich byl nastíněn v K regionu jako kalmodulin- (CaM-) vázání IQ motivem a později, odkaz na IQ motiv na CDI jako funkční Ca2+-CaM vazebné místo byla potvrzena ve třech nezávislých studií o použití CaM mutanti postrádající afinitu k Ca2+. V souladu s tím byl motiv LA spojen s CDI jako vazebné místo apo-CaM obdařené klidovým stavem kanálu. Jedna molekula CaM uvázaná s touto doménou vázající se na Ca2+(CBD) A1c je hlavním senzorem Ca2+ kanálu .

Splice varianty a1C v CBD oblasti a1C,86 nejen zcela inhibuje CDI, ale také odstraňuje SI (viz Obrázek 3(B), panel c) a zbavuje kanál diferenciální citlivost na β-podjednotku modulace (Obrázek 3(B), panel e) a to i přes skutečnost, že β zůstává spojena s a1C,86 (Obrázek 3(B), panel b). To znamená, že všechny tři vlastnosti kanálu—modulace CDI, SI a β-podjednotky—jsou spojeny dohromady .

3.2. Pomalá inaktivace

bylo prokázáno, že aminokyseliny omezené na distální část segmentů S6 v A1C hrají důležitou roli v SI . Systematické studium této oblasti je uvedeno „roční determinant pomalé inaktivace“ (ADSI) jako strukturu složenou ze čtyř vysoce konzervované aminokyseliny ze čtyř transmembránových segmentů S6, tvoří cytoplazmatický konec pórů (viz Obrázek 3(A), panel a). Jejich současné mutace (S405I v IS6, A752T v IIS6, V1165T v IIIS6, a I1475T v IVS6) generuje a1C,JE-IV kanálu. Analýza současné kinetiky kanálu A1C, IS-IV ukázala obrovské zrychlení rychle inaktivující složky (≤ 10 ms), která zahrnuje asi 50% celkové (nebo ) amplitudy. Pomalá inaktivace A1C závislá na napětí, IS-IV je plně inhibována a kanál zůstává vodivý po dobu depolarizace. Výměna Ca2+ Ba2+, protože nosiče náboje (panel c) významně nezměnily tento vzor inaktivaci, zatímco analýza napětí v závislosti na inaktivace složky prostřednictvím a1C,JE-IV kanálu (panel d) potvrdil nedostatek CDI. Výměna ß1a pro ß2a (panel e) nezměnil inaktivaci a1C,JE-IV kanálu aktuální naznačuje nedostatek diferenciální β-podjednotky modulace, zatímco co-immunoprecipitation analýzy (panel b), za předpokladu, přímý důkaz o přidružení mezi a1C,JE-IV a β.

celkově vzato, výsledky prezentované v grafu 3 naznačují, že tam je cross-talk mezi ADSI, CBD a β, podpořeny přímé interakce mezi nimi a/nebo specifické konformační skládání složek polypeptid svazek hlubších pórů. Jak interakce β S CBD, tak význam funkční konformace byly přímo demonstrovány v živých buňkách exprimujících rekombinantní Cav1. 2.

3.3. Role a1C C-ocas Skládací

Kvantitativní napětí závislé FRET mikroskopie v kombinaci s patch clamp v živé buňce ukázalo, že a1C podjednotky C-terminální ocas je předmětem reverzibilní napětí-gated konformační přestavby . Zakotvení a1C C-ocas k vnitřní informaci plazmatické membráně prostřednictvím pleckstrin homology (PH) domény fúzované k C-konci a1C (a1C-) zrušil tato konformační uspořádání a inhiboval SI a CDI (Obrázek 4(A)) způsobem, který je velmi podobný tomu, který pozorované s a1C,JE-IV (Obrázek 3(C)). Tato modifikace omezující pohyblivost karboxylového konce A1C měla zásadní vliv na přenos signálu Ca2+. CREB-dependentní transkripční aktivace spojené s činností Cav1.2 byl zcela potlačen navzdory robustní generované „C-ukotvené“ kanálu v odezvě na depolarizační. Vydání a1C C-ocas aktivací hydrolýzy PIP2 při aktivaci fosfolipázy C plně obnoví všechny tyto deficitní funkce, včetně SI, CDI, a efektivní spojení na CREB-dependentní transkripce . Pro inaktivaci je tedy rozhodující specifické funkční skládání ocasu A1c C-terminálu. To je zásadní pro přenos signálu, protože to je navržen tak, aby klec impregnaci Ca2+ v CaM připojené k CBD a efektivně přesunout kleci Ca2+ proudu signalizace cíle spojené s CREB-dependentní transkripce nebo srdeční svalové kontrakce . Především se tato funkce vyskytuje v těsné koordinaci s extracelulárními podněty aktivujícími kanál. Z hlediska přenosu signálu, SI je zámek na vnitřní kanál, který je propuštěn na prostupující Ca2+, k urychlení jeho uzavření a zahájení pohybu C-koncové ocas .

Obrázek 4

Diferenciální úlohu karboxylovou a amino-terminální ocasy α 1C v Cav1.2 inaktivaci. Zobrazeny jsou (a) epifluorescent obrázky ilustrující plazmatické membrány zaměření EYFP-označené α 1C (škálování bary, 4 µm) a (b) překrývá stopy maximální (černá) a (červené) zmenšen na stejnou amplitudu pro α 1C-/β 1a/α 2δ , (A) PHN-α 1C/2δ α (B) , a ΔN-α 1C/2δ α (C) .

3.4. Role A1c N-konce

všechny výše uvedené funkce závisí také na integritě A1C n-konce. Inaktivační vlastnosti rekombinantního kanálu A1C / β / α2δ nejsou významně změněny strukturálními změnami proximální části A1c N-ocasu, například fúzí fluorescenčního proteinu, doménou PH nebo alternativním sestřihem exonů 1 / 1A generujících dlouhou izoformu A1C . Úplně první Funkční analýza účinku částečné delece a1C n-konce ukázala, že se podílí na inaktivaci, zatímco β zabraňuje inhibici kanálu N-ocasem. Pomocí FRET mikroskopie v kombinaci s patch clamp, zjistili jsme, že inaktivace způsobuje silné vzájemné orientace a1C a ß1a NH2-termini, ale jejich vzdálenost vis-à-vis plazmatické membrány není výrazně změnil . Tento relativní nedostatek mobility je způsoben β způsobem, který usnadňuje odezvu kanálu na napěťové hradlo. Pokusy o odpojení N-koncového ocasu podjednotky A1c od regulace kanálu byly provedeny v nepřítomnosti β. Ukotvení n-ocasu a1C ve vnitřním letáku plazmatické membrány prostřednictvím připojené domény PH vytvořilo podmínky, kdy PHN-A1C a α2δ stačily k vytvoření robustního proudu dovnitř (obrázek 4(B)). Tento kanál je však zbaven CDI a jakékoli inaktivace závislé na napětí. BA2+ ani Ca2+ proud skutečně nevykazoval znatelný rozpad (viz překrývající se stopy). Uvolnění A1c n-tail po hydrolýze PIP2 aktivací fosfolipázy C zcela inhibovalo β-deficitní kanál . Podobné vlastnosti, s výjimkou mnohem pomalejší aktivace aktuální, byly pozorovány na smazání celé (ale 4 aminokyseliny), N-terminální ocas a1C (Obrázek 4(C)). U obou typů odpojit, a1C N-terminální ocas—ať už formou výmazu nebo PM kotvení,—zpoždění při aktivaci celých buněk aktuální se zdá být spojena s prodloužením latence první. Jednokanálové záznamy odhalily, že delece n-ocasu v podstatě stabilizovala otevřený stav kanálu ΔN-a1C / α2δ, který vykazoval delší otvory během dlouhodobé depolarizace .

CDI je tedy zprostředkován determinanty CBD C-ocasu a1C, ADSI v oblasti cytoplazmatických pórů a skládáním A1c C – A N-termini. Kalmodulin integruje tyto determinanty, které poskytují Ca2+-závislé přepínač, který ukončí pomalá inaktivace, uvolňuje a1C C-ocas, a raketoplány související Ca2+/kalmodulin, která působí jako aktivace stimulaci Ca2+ signální transdukce .

3.5. Výraz a Inaktivace Cav1.2 v Nepřítomnosti β a α2δ

Jsou β a α2δ podjednotky nezbytné pro funkční vyjádření Cav1.2 kanál? Analýza účinků exogenního CaM (CaMex) na expresi a vlastnosti Cav1.2 v nepřítomnosti buď β nebo α2δ jasně ukázala, že ani β, ani α2δ je zásadní. Zvýšená exprese CaMex jen mírně upraví napětí vtokové z a1C/ß2d/α2δ kanál tím, že přesouvá napětí závislost aktivace a inaktivace k více negativních potenciálů, usnadnění (ale nesmí zrychlovat) inaktivace, a zvýšení hustoty přibližně 2-násobně . CDI je zachován, jak je patrné z vlivu nahrazení Ca2+ Ba2+ jako nosiče náboje, které výrazně zvýšil časový průběh inaktivace proudu (Obrázek 5(A)). Nové chápání role β a α2δ přichází se zjištěním, že CaMex činí projevu a činnosti a1C kanálu v nepřítomnosti β (Obrázek 5(B)), nebo α2δ (Obrázek 5(C)), ale ne oba tyto pomocné podjednotky. Ačkoli CaMex je strukturálně nesouvisí s β a α2δ, podporuje obchodování, CDI, a kanál gating. Kvantitativní analýza ukázala, že CaMex nestimuloval přerozdělování a1C v PM přes cytoplazmu, ale výrazně zvyšuje plazmatické membrány zaměření a1C/α2δ programy. Na druhou stranu, CaMex ani zvýšit relativní distribuce a1C/ß2d a a1C/ß2d/α2δ kanály v plazmatické membráně přes cytoplazmu. V závislosti na přítomné pomocné podjednotce je tedy aktivita kanálu podporovaná Camexem a1C/ß2d a A1C/α2δ pod kontrolou různých mechanismů. Navzdory tomu, CaMex-usnadněno, single-pomocné-podjednotky programy vykazují velmi podobné vlastnosti, včetně výrazně pomalejší kinetiky inaktivace vápníku aktuální a silný posun napětí závislost aktivace a inaktivace k více negativní potenciály. Podobně jako u konvenčních kanálů a1C / ß2d / α2δ si tyto kanály zachovávají CDI a vysokou citlivost na blokátory vápníkových kanálů dihydropyridinu . Avšak pouze kanál a1C/β/CaMex vykazuje usnadnění kalciového proudu silnou depolarizací prepulse (údaje nejsou zobrazeny).

Obrázek 5

Aktivita Cav1.2 vyjádřena v nepřítomnosti β nebo α 2δ podjednotek. Zobrazeny jsou (a) epifluorescent obrázky ilustrující převládající PM lokalizace EYFPN-α 1C (škálování bary, 4 µm) v COS1 buňky a (b) překrývá stopy maximální (černá) a (červené) zmenšen na stejnou amplitudu pro α 1C/β 2d/2δ α/CaMex (A), β-α zdarma 1C/2δ α/CaMex (B) a 2δ α-α zdarma 1C/β 2d/CaMex kanálu (C).

Protože CaM spojené s CBD je zapojen do CDI, je jasné, že účinek CaMex je zprostředkován různými CaM-vazebné místo(y). Jeden z potenciálních kandidátů takového místa je přítomen v distální části ocasu A1c N-terminal . Zbývá zjistit, zda toto místo skutečně hraje integrační roli v regulačním svazku několika molekulárních determinantů podporujících inaktivaci Cav1. 2. Další možnost omezuje roli Camexu na aktivaci Tichého Cav1.2 v rámci velkých shluků, kde omezená místní dostupnost CaM může být příčinou nízké frakční aktivity popsané v bodě 2.5. Ať mechanismy spojené s nařízením o Cav1.2 CaM jsou, zdá se, mají malý praktický dopad pro využití v medicíně v této době právě proto, že CaM je všudypřítomné a multifunkční peptid, který reguluje mnoho dalších buněčných funkcí, zatímco jeho přítomnost v Cav1.2 je životně důležité pro CDI.

4. β-Podjednotková modulace Cav1.2

Pozoruhodné molekulární variability β podjednotek, který se odráží ve změněné inaktivace vlastnosti rozdílně modulovaný Cav1.2 , ilustrovaný na Obrázku 3(A) (panel e) představuje novou příležitost pro rozvoj inovativních přístupů k léčbě nemocí spojených s Ca2+ opotřebováním. Několik nedávných pozorování poskytuje základ pro takový optimistický pohled. Za prvé, β podjednotky vykazují tendenci tvořit homo – a hetero-oligomery, která byla přímo demonstrována různými biochemickými technikami jak v nativních buňkách, tak v rekombinantním expresním systému. Zatímco na zvětšení β homooligomerization výrazně zvyšuje hustotu , heterooligomerization β2 splice varianty s ostatními β podjednotek se může také měnit napětí-závislost a kinetiky inaktivace z Cav1.2 . Β-oligomerizace je zprostředkována několika molekulárními determinanty, a proto je třeba zvládnout více intervencí, například v případě patogenní nadměrné exprese β2. Nicméně, to se zdá být schůdnější cíl β2 sám; molekulární determinant β2-specifické pomalá a neúplná inaktivace (viz Obrázek 2(A), panel d) byl identifikován jako 40-aminokyselin C-terminální determinant (ß2CED) přítomna ve všech 7 známých přirozeně se vyskytující β2 splice varianty. Odpojení jeho Ca2+- CaM-nezávislé interakce s CBD (Obrázek 3(A), panel a) obnoví inaktivace vlastnosti charakteristické pro ß1b/β3-modulovaný Cav1.2 vystavovat rychlé a úplné inaktivaci , jak to bylo uvedeno v mazání experimentů. Podle mého názoru je takové selektivní odpojení ß2CED od vazby na jeho receptor v CBD novou atraktivní strategií pro řízení přetížení Ca2+, protože jiné β podjednotky nemají být ovlivněny. Kromě toho bude zachována křížová řeč mezi Cav1.2 a nejbližší cílovou Ca2+/CaM-dependentní proteinkinázou II.

5. Závěry

Tento papír prokázal, že víme, jak urychlit inaktivace Cav1.2 na méně než 10 ms (Obrázek 3(C)), zbavit ji z inaktivace úplně (Čísla 4(B) a 4(C)), nebo eliminovat závislost jeho vyjádření z β nebo α2δ bez významné důsledky pro inaktivaci. Jsme nastínil konečný role a1C termini a CaM pro inaktivaci, a přesto žádná z těchto studií nás přivedla blíž ke konečnému cíli řízení vápníku špatného zacházení spojené s Cav1.2 s výjimkou starých a bohužel ne příliš selektivních blokátorů kalciových kanálů. Jediným novým proveditelným cílem je patogenní β2 modulace Cav1. 2, Kde je navázána interakce efektor-receptor.

z hlediska molekulární biologie patří Cav1. 2 jistě mezi nejsložitější známé regulační systémy. Pozoruhodná molekulární rozmanitost každého z Cav1.2 složek dává vzniknout mnoha genetických/splice variant kanálu, které jsou předmětem segregace do velké a různorodé uskupení a kontinuální funkční změnit pomocí homo – a hetero-oligomeraci β a dalších signálních komponent, nemluvě o druhy, tkáně a vývojové variability. Jsme překvapeni tím, že nadbytečnost vlastnosti více Cav1.2 izoformy a jsou ještě více překvapeni, když někteří z nich, ukazuje jen „konvenční“ elektrofyziologické vlastnosti, se ukáže být spojeno s nemocí . Při hledání vysvětlení, náš pohled by neměl být intuitivně zaměřen pouze na charakteristiky závislosti proudu vápníku-napětí, amplituda, a trvání. Konec reakce, jako jsou prostorové a časové organizace CREB signalizační události spojené s konkrétní Cav1.2 izoformy , a jeho konkurenci s jinými (např. cAMP dependentní) signalizační mechanismy, nebo jiné Cav1.2 izoformy současné době, může poskytnout nové myšlenky a otevřít nové hranice pro vyšetřování role jednotlivých Cav1.2 splice varianty v normální a nemocné buňky a tkáně.

Abbreviations