Zvířata

dania pruhovaného byly udržovány na 28.5 °C dne 14 hod/10 hod světlo cyklu v Danieau řešení . Kombinatorické crystal mutant (albb4/b4;nacrew2/w2;roya9/a9) byl vytvořen postupně křížení tří rozdílných jeden mutantní kmeny, a to nacrew2/w2 (ref. 9), roya9/A9 (ref. 4) a albb4/b4 (ref. 18) mutanti. Důležité je, že jak larvy, tak dospělí zebrafish jsou životaschopné a nevykazují viditelné morfologické, funkční nebo behaviorální abnormality jiné než pigmentační fenotyp. Casperův mutant byl získán křížením mutantů nacrew2 / w2 a roya9/A9, jak bylo dříve popsáno4. Linie AB byla použita k Získání divokého typu zebrafish. Transgenní linie použité v této studii zahrnují Tg (elavl3:GCaMP5G)21 a Tg (elavl3:GCaMP6f)28. Konfokální funkční zobrazovací experimenty byly provedeny v mutantu perleti. Experimenty se zobrazováním světelného listu byly provedeny v mutantech perleti, Casperu a krystalů. Dvoufotonové funkční zobrazovací experimenty byly provedeny v krystalových larvách. K léčbě danio pruhované larvy s PTU jsme sledovali standardní procedures8, konkrétně larvy byly vzneseny v 200 µM PTU (Sigma) v Danieau řešení od 24 hodin po oplodnění (hpf). Tg(elavl3:GCaMP5G) larvy používá pro konfokální funkční zobrazování vizuálně evokované nervovou činnost zrakového tectum byli léčeni s 200 µM PTU od 24 hpf 3 dpf a zobrazen na 4 dpf. Tato práce byla schválena místní životní podmínky Zvířat a Etické Recenzi Tělo (King ‚ s College London) a byla provedena v souladu se Zvířaty (Vědecké Postupy) z roku 1986, na základě licence od Spojeného Království Home Office (PPL70/8057).

Zobrazovací

Celé zvíře in vivo mikroskopie

Celek-obrázky zvířat dospělých danio pruhované byl pořízen s Nikon D7000 digital SLR fotoaparát vybaven Sigma 150 mm makro objektiv. Dospělí zebrafish byli anestetizováni 0.2% tricain (MS222, Sigma) ve vodě rybích zařízení a umístěn do Petriho misky o průměru 90 mm obsahující vodu z rybích zařízení. Zobrazování larev bylo provedeno pomocí Axioskopu ZEISS připojeného k CCD kamerám Exi Blue (Retiga) a softwaru Volocity acquisition (PerkinElmer). Larvální zebrafish byly anestetizovány 0,02% tricainem v roztoku Danieau a imobilizovány v 1% agarose s nízkou teplotou tání (Sigma) na skleněných sklíčkách.

konfokální kalciové zobrazování

zobrazování bylo provedeno pomocí konfokálního mikroskopu ZEISS LSM 710 vybaveného spektrální detekční skenovací hlavou a 20x/1.0 NA cíl ponoření do vody (Carl Zeiss). Funkční čas-série vizuálně evokované vápníku odpovědi sítnicových gangliových buněk (RGCs) byly získány ve výši 4.1 Hz a 0.415 × 0.415 µm rozlišením (256 × 256 pixelů), a 1 AU dírkové clony. Budicí světlo bylo zajištěno 488 nm víceřádkovým laserem. Non-anestezie Tg(elavl3:GCaMP5G) larvy byly imobilizovány v 2% nízký bod tání agarózy (Sigma), připravené v Danieau řešení a montáž hřbetní stranou nahoru na vyvýšené sklo platforma, která byla umístěna ve zakázku Danieau-naplněné komory. Agaróza byla dostatečná k omezení larev, takže nebyla nutná anestezie. Zobrazování bylo provedeno odpoledne (1-8 pm).

Světla-list zobrazovací

Whole-brain light-sheet zobrazovací byla provedena pomocí ZEISS Lightsheet Z. 1 mikroskop vybaven dvěma 10X/0.2 NA osvětlení cíle a jeden 20X/1.0 NA vodě-ponoření detekce cíle (Carl Zeiss). K vyvolání fluorescence GCaMP6f bylo použito laserové excitační světlo 488 nm a pro detekci emitovaného světla byl použit filtr 505-545 BP. Otočný skener (Carl Zeiss) byl použit k zajištění homogenního osvětlení, a proto se vyhýbal stínům podél osy osvětlení. Tloušťka světelného listu byla 5,39 µm ve středu a 10,8 µm na okrajích zorného pole. Doba expozice byla 29.97 ms. Velikost objemového obrazu byl 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixelů) s rozlišením 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 dpf perleti, casper a crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) larvy byly nejprve paralyzován po dobu 10-15 minut v α-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium), připravené v Danieau řešení. Následně byly larvy imobilizovány ve 2% agaróze s nízkou teplotou tání (Sigma) a umístěny uvnitř skleněné kapiláry (objem 20 µl, 701904; značka). Následně jsme extrudovaný sekce agarózy válec obsahující hlavy larva z kapiláry, a orientované larvy tak, že na hřbetní straně hlavy byl čelí detekce cíle a oči, kterým čelí dvěma osvětlení cíle. Whole-brain light-sheet zobrazení casper mutantní larvy byla provedena pomocí zakázku světlo-list, mikroskop, postavený Dr. Martin Meyer (King ‚ s College London) a je vybaven 20X/1.0 NA vodě-ponoření XLUMPlanFLN detekce cíle (Olympus).

Two-photon vápníku zobrazovací

Two-photon funkční zobrazování v sítnici byla provedena pomocí Nikon A1R MP mikroskop vybaven 4-kanálový GaAsP NDD a Apochromat 25X/1.1 NA vodu-imerzního objektivu (Nikon). Excitace byla zajištěna režimem Chameleon Ultra II-uzamčený Titan-safírový laser (koherentní) naladěný na 930 nm. Časové řady vizuálně evokovaných reakcí vápníku byly získány rychlostí 4 Hz a rozlišením 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 pixelů). Po aktivaci laserového skenování, čekali jsme, 60 sekund před zahájením vizuální stimulace k zajištění sítnice přizpůsobit pozadí, úroveň osvětlení způsobené multi-photon laser. 4 dpf crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) larvy byly nejprve paralyzován po dobu 10-15 minut v α-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium), připravené v Danieau řešení. Následně larvy byly imobilizovány v 2% nízký bod tání agarózy (Sigma) a montáž na vyvýšeném zakázku sklo platforma s hřbetní stranou nahoru (45° úhel náklonu) a jedno oko čelí LCD obrazovky (viz Vizuální stimulace), která byla umístěna pod zakázku Danieau-naplněné komory. Zobrazování bylo provedeno odpoledne (1-8 pm).

vizuální stimulace

pohyblivé tyče v konfokální přípravě

pohyblivé tyče podněty byly generovány, jak bylo dříve popsáno22,33. Difuzní filtr (3026, Rosco) byl připojen k jedné straně komory, aby sloužil jako projekční plátno. Agarózy v přední části oka směrem k projekční ploše byla odstraněna, což umožňuje nerušený výhled na promítaný obraz na straně komory. Larvy byly umístěny 3 cm od obrazovky a promítaný obraz vyplnil zorné pole ~97° × 63°. Vizuální podněty se skládaly ze světla (56 cd / m2) nebo tmavých pruhů (8 cd/m2) (175% a 25% průměrné svítivosti) na Středním šedém pozadí (32 cd/m2). Protože nebyly zaznamenány žádné kvalitativní rozdíly mezi světlými a tmavými pruhy, data získaná pomocí dvou podnětů byla kombinována. Každý bar byl 10° v šířce pohybující se rychlostí 20°/s a oddělených od předchozího panelu o 30°, což umožňuje více než jeden panel na obrazovce v jednom okamžiku. Dlouhé osy tyčí byly kolmé ke směru pohybu. Každý z 12 směr pohybu byl prezentován jednou (3 sekundy) v pseudo-náhodném pořadí jedinečné pro každý řez v každé zvíře segmentu. Každý interval mezi epochami byl 10 sekund, aby se signály GCaMP5G vrátily k základní linii. Byla také prokládána nulová podmínka prázdné obrazovky 2 sekundy. Vizuální experimenty byly vytvořeny a ovládány pomocí vlastní-písemné Labview a MATLAB code (MathWorks), realizován na Vizáž stimul moderátor (Cambridge Research Systems) a doručen prostřednictvím DLP Pico Projektor (Optoma).

Pohyblivé rošty ve dvou-fotonová příprava

Pohyblivé rošty podněty ve dvou-fotonová přípravy byly vytvořeny a ovládány pomocí PsychoPy39, a vydal přes LCD displej (SKD5VA-3, GoodWell Technologie) umístěné pod ním na zakázku, Plexi komory. Dlouhé-pass červený skleněný filtr (FGL610, Thorlabs) byl umístěn mezi LCD displej a komora umožňující simultánní zobrazování a vizuální stimulace. Larvy byly umístěny 2 cm od obrazovky a obraz na LCD obrazovce vyplnil zorné pole ~140° x 100° (průměr jasu pozadí 30.4 cd/m2). Vizuální podněty se skládaly ze čtvercových vlnových mřížek (100% kontrast, prostorová frekvence 1,66 cyklů / cm, časová frekvence 1 cyklů/s). Každá mřížková tyč měla šířku 8,5° a dlouhé osy tyčí byly kolmé ke směru pohybu. Každý z 12 směr pohybu byl prezentován jednou (6 sekund) a inter-epocha interval 10 sekund, povolit GCaMP6f signály k návratu k výchozímu stavu. Byla také prokládána nulová podmínka prázdné obrazovky 6 sekund. TTL spouští (0-5-0 voltů) pro záznam epoch čas události, kde generované přes LabJack USB DAQ zařízení (U3-LV, LabJack Corporation). Po aktivaci laserového skenování, čekali jsme, 60 sekund před zahájením vizuální stimulace k zajištění sítnice přizpůsobit pozadí, úroveň osvětlení způsobené multi-photon laser.

test Optomotorické odpovědi

jednotlivé larvy 5 dpf byly umístěny do 35 mm Petriho misky obsahující Danieauův roztok. LCD displej iPhone 5 (Apple) řízen MacBook Pro (Apple) přes Duet Display (Kairos Technologies) byla použita k zobrazení černé a bílé square-wave rošty (85% kontrast, prostorové frekvence 0.33 cykly/mm, temporální frekvenci 3.5 cyklů/s) pohyb ve 4 směrech (90° úhlové vzdálenosti) na dno petriho misky. Vizuální podněty byly generovány v Keynote (Apple). Každá larva byla testována 5 krát celkem (každý proces trval 6 s, poté 10 s statické rošty) a zaznamenal podle hodnocení to reagoval (tj. ryby se otočí a plave ve směru pohyblivé rošty). Chování larev bylo vizuálně sledováno pomocí stereomikroskopu M165 FC (Leica).

analýza

funkční analýzy

in vivo zobrazovací údaje vápníku byly analyzovány, jak bylo dříve popsáno22,33. Stručně řečeno, funkční časové řady byly zpracovány před analýzou následovně: čas-série snímků z každého experimentu byly opraveny na motion s tuhou-tělo algoritmus (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), medián filtrované s jádrem velikosti 1 voxel odstranit tmavé a střílel hluku a prostorově vyhlazená s 2D Gaussova jádra = 2 voxelů zlepšit signál-šum. Základní (B), která opravuje pro nízkofrekvenční závěje byla stanovena pomocí kubických spline algoritmus extrapolace mezi uzly v průměru od 5 s inter-epocha interval data. Obě relativní změny intenzity signálu (ΔF = F-B; kde F = surová fluorescence) a normalizované změny intenzity signálu byly vypočteny při každém voxelu. ΔF byl použit pro populační funkční data (voxelova analýza), zatímco %ΔF/F0 bylo použito pro ručně definované oblasti zájmu (Roi). Pro každý voxel nebo ROI byla vypočtena integrální odezva v epochovém intervalu, aby poskytla jedinou metriku odezvy každého prezentovaného směru pohybu stimulu. Integrál v každém epochovém okně je souhrnná metrika odolnější vůči saturačním účinkům vápníkové sondy než Maximální změna signálu. Prahová hodnota pro každý voxel v sekvenci akvizičního obrazu byla stanovena z rozptylu změn ΔF během intervalů mezi epochami a nulovou podmínkou, prahová hodnota = 5 × SDs. Všechny voxely, které byly nadprůměrné během alespoň dvou vizuálních prezentačních epoch, byly považovány za vizuálně citlivé a podrobeny další charakterizaci.

analyzovat směr a orientaci selektivita vizuálně citlivý voxelů směr a orientaci-selektivní indexy (DSI a OSI)40, na základě vybavená von-Mises, nebo Gaussian profiles41, byly vypočteny spolu s odhadem jejich dobrota fit, R2. DSI byla definována jako (Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), kde Rpref, reakce na preferovaný směr, byl nedílnou odpověď přes preferovaný směr epocha-interval. Rnull byl podobně vypočítán jako integrální odezva vyvolaná směrem opačným k preferovanému směru. OSI byla definována jako (Rpref−Rorth)/(Rpref + Rorth), kde Rpref, reakce na přednostní orientaci, byl nedílnou odpověď přes přednostní orientace epocha-interval. Rorth byl podobně vypočítán jako integrální odezva vyvolaná ortogonální orientací. Aby se minimalizovala křížová řeč a nadměrná montáž spojená s metrikami DSI a OSI, byl proveden přísný přístup. Pro voxel být považován za směr-selektivní (DS) nebo orientace-selektivní (OS), vzájemně se vylučující kritéria byly použity: DS-li RP > 0,5 a OSI < 0.5; a OS pokud OSI > 0.5 a DSI < 0.5. V obou případech musela být dobrota fit (R2) pro DSI a OSI >0,8; takto osazené křivky vysvětlily alespoň 80% integrálních odpovědí. Jediný von-Mises distribuce byl použit, aby se vešly odpovědí DS voxelů a odhad jejich preferovaný směr pohybu úhel od centra proloženou křivku. Součet dvou von-Mises (180° úhlové vzdálenosti od sebe), byl použit, aby se vešly reakce OS voxelů a odhad jejich přednostní orientace pohybu úhly od centra proložené křivky. Kruhový rozptyl byl také vypočítán pro srovnání jako alternativní metrika orientační selektivity (Kruhový rozptyl < 0.4)41.

morfologické analýzy

pro stanovení objemu mozku zobrazeného ve 4 DPF perleti, Casperu a krystalu Tg (elavl3:GCaMP6f) larvy, spočítali jsme počet GCaMP6f+ voxelů v každém objemový obraz použitím upravit>práh následuje funkce analyzovat>histogram>seznam příkazů v ImageJ42. Následně byly získané hodnoty vynásobeny objemem jednoho voxelu (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

statistické analýzy

statistické výsledky testů jsou uvedeny v číslech a číselných legendách. Statistické analýzy a testy byly provedeny pomocí Prism 6 (GraphPad) nebo MATLAB R2014b (MathWorks). Před provedením statistických testů byly k výběru vhodného statistického testu použity popisné statistiky (např. testy normality, aby se zjistilo, zda hodnoty pocházejí z Gaussova rozdělení nebo F-test pro porovnání odchylek). Kritérium statistické významnosti bylo stanoveno na p < 0.05.