návrh Studie

VX-765 obor: Pět-měsíc staré vozidlo-injekčně WT (WT + vozidlo; n = 18) a J20 myší (J20 + vozidlo: n = 14), a VX-765-injekčně J20 myší (J20 + VX-765: n = 13) myši byly podélně hodnoceny v pěti různých časových bodech: výchozí hodnoty před léčbou (baseline neléčí J20 byly seskupeny dohromady; n = 19), po třech IP injekce týdně VX-765 nebo vozidla (Léčba 1), po šesti další injekce více než 2 týdny (Léčba 2), po 4-týdenní období vymývání (WO), a po další tři injekce v 1 týden (Léčba 3) (Obr. 1a). Všechna zvířata testovány byly zahrnuty do analýzy, pokud (a) zvíře zemřelo během experimentu, nebo (b) zvíře se behaviorálně reagovat. Bylo použito celkem 25 vrhů, rozložených do čtyř různých kohort a testovaných v různých časech. Tři z těchto kohort podstoupily testování NOR a open field, zatímco kohorta 4 byl použit pro Barnes maze. Po zvířata byly testovány základní potvrdit, že J20 zvířata byla behaviorálně deficit, J20 zvířata byla náhodně přiřazena buď vozidlo, nebo VX-765 zacházení, nezávislé na chování, výkon. Ze všech použitých zvířat nevykazovaly čtyři myši J20 na začátku experimentu žádné deficity chování a nebyly použity. Dvě myši vehikula J20 + se během experimentu vůbec nepohybovaly a jejich behaviorální údaje byly vyloučeny; tato zvířata však byla chována a byla stále používána pro posmrtnou analýzu.

validační studie Casp1: k ověření účinků VX-765 specifických pro Casp1 byly myši J20 generovány na pozadí Casp1−/−. Bylo použito sedmdesát tři myší (n = 12-13 na genotyp, šest různých genotypů), z nichž všechny byly chovány in vitro fertilizací (IVF) od 35 dárcovských žen. Podrobnosti o chovu jsou popsány v části studie na zvířatech níže. Všechny myši byly hodnoceny behaviorálně ve věku od 7 do 8 měsíců a žádná zvířata nebyla z této studie vyloučena.

všechny myši byly obětovány a zpracovány ve věku 8 měsíců. Behaviorální hodnocení bylo zaslepeno genotypem a léčbou myší a všechna zvířata byla náhodně přiřazena k biochemické nebo histologické analýze a slepě analyzována.

VX-765, VRT-043198 IC50 testy na rekombinantní caspases

Zvířata studie

Všechny živočišné postupy Kanadské Rady o Péči o zvířata, pokyny a byly schváleny McGill University Péče o zvířata výboru. J20 transgenní myší linie (Jax Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) vyjadřuje švédské (670/671KM→NL) a Indiana (717V→F) lidské APP mutací pod PDGF-ßpromoter. Samci myší J20 byli používáni jako chovatelé a jejich spermie byly použity pro expanzi kolonií IVF.

genotypy byly stanoveny biopsií ocasu a RT-PCR. Myši byly umístěny ve skupině (2-4 zvířata v kleci) ve standardních makrolonových klecích za 12hodinového cyklu zpětného světla / tmy a kontrolovaných podmínek prostředí. Jídlo a voda byly k dispozici ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) byl rozpuštěn ve 20% cremophor v dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) a intraperitoneálním podání. Myši J20 a WT ošetřené vehikulem dostávaly pouze cremophor.

analýza propustnosti hematoencefalické bariéry

pětiměsíční myši J20 a WT byly anestetizovány isofluranem a pravá krční tepna byla oddělena. Podél krční stěny byl proveden malý řez a do vstupu vnitřní krční tepny byl vložen mikrokatétr. Katétr byl zajištěn na místě pomocí šicí nitě. VX-765 (50 mg kg−1) byl podán infuzí při 50 µl min-1 (celkový objem 90-120 µl). Mikrokatétr byl ponechán dalších 5 minut, aby se umožnila difúze, po které byla krev odebrána intrakardiální punkcí. Myš byla transkardiálně perfundována ledově studeným fyziologickým roztokem a hippocampus a kůra byly rozřezány. Vzorky byly odeslány na platformu Biopharmacy (Université de Montreal)pro kapalinovou chromatografii a tandemovou hmotnostní spektrometrii.

behaviorální analýza

otevřené pole: pohybová aktivita byla měřena pomocí automatizovaného sledovacího systému HVS2100 (HVS Image, Hamptom, UK). Myši byly umístěny do otevřené pole Komory (40 × 40 cm plexisklo box, žádný strop, a bílá podlaha) a nechá se prozkoumat po dobu 5 minut.

nové rozpoznávání objektů (NOR): myši byly předem vystaveny dvěma identickým objektům v otevřené komoře po dobu 5 minut. Dvě hodiny po předběžné expozici byly myši umístěny zpět do komory a vystaveny jednomu známému objektu a jednomu novému objektu po dobu 5 minut. Myši byly vystaveny určitému objektu pouze jednou v různých testovacích relacích a nové umístění objektu bylo vyváženo v každé léčebné skupině. Procento dotkne románu objekt během testovací fáze a diskriminace index ((# dotýká román − # dotkne známé)/celkový dotkne) byly posouzeny.

Barnes maze: platforma Barnes maze (průměr 91 cm, vyvýšená 90 cm od podlahy)sestávala z 20 otvorů (každý o průměru 5 cm). Všechny otvory byly blokovány s výjimkou jednoho cílového otvoru, který vedl k zapuštěné únikové krabici. Prostorové podněty, jasné světlo a bílý šum byly použity k motivaci myší k nalezení úniku během každé relace. Pro fázi adaptace, každá myš prozkoumal platformu pro 60 s. Všechny myši, které nebyly najít escape box byl veden k ní a zůstal tam po dobu 90 sekund. Pro získání fázi, každý pokus následoval stejný protokol, s cílem trénovat každé myši najít cíl a zadejte uniknout box do 180 s. Myši zůstal v krabici za dalších 60 sekund. Čtyři pokusy za den, přibližně 15 min od sebe, byly provedeny pro 4 po sobě jdoucích dnů. V testu sondy (den 5) provedla každá myš jednu 90s studii. Cíl byl stále umístěn ve stejné pozici, ale únikový box byl zablokován. Byla měřena latence a chyby k dosažení cíle plus počet šťouchnutí myší do každé z otvorů (Cílová preference). Y-Bludiště se skládá ze symetrické ve tvaru Y bludiště se třemi rameny 120° od sebe, označené A, B, a C. Zvířata byly umístěny na distálním konci paži a nechá prozkoumat bludiště dobu 5 min. Byly zaznamenány celkové záznamy ramen a spontánní střídání, definované jako po sobě jdoucí záznamy ve třech různých ramenech. Bylo stanoveno procentuální střídání.

zpracování Tkání

Pro imunohistochemii, myší (n = 4 až 6 v každé skupině) byly anesthetised s isofluorane a transcardially prostoupen ledově chladný solný roztok, následuje ledová 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) v 0,1 M fosfátového pufru. Mozky byly postfixovány v 10% formalinu s neutrálním pufrem (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) po dobu 16 hodin a přeneseny na 70% ethanolu. Mozky byly vloženy parafinem a rozřezány na 4 µm.

Pro western blot a ELISA (n = 4 až 8 v každé skupině), anesthetised myši byly cervically vykloubené, hipokampu a kůře členitý a okamžitě zmraženy na suchém ledu. Proteiny byly extrahovány v 5× objem/hmotnost s radioimmunoprecipitation test (RIPA) pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0.25% Na-deoxycholát, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Proteasy Inhibitory Koktejl (Sigma-Aldrich)) na led s tkání homogenizátoru (OMNI International, Kennesaw, GA, USA). Vzorky byly centrifugovány (20 000 × g, 4 °C) po dobu 20 minut, supernatant byl získán a protein kvantifikován metodou BCA. Ripa-nerozpustná peleta byla dále extrahována v 70% kyselině mravenčí v dH2O, odpařena a resolubilizována v 200 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Imunohistologické barvení

epitopy byly demaskovány buď citrátem (10 mM Tris-na citrát, pH 6,0) nebo EDTA (10 mM Tris báze, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) antigen retrieval pufr, a imunostained pomocí Dako Autostainer Plus automated slide procesor a EnVision Flex systém (Dako, Burlington, ON, Kanada). Následující deparaffinization a rehydratace, sekce byly peroxidázy léčit, blokován v séru-zdarma bílkovin blok, a immunostained s následující protilátky zředěné v EnVision Flex Antibody Diluent: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-Aß1-40 (F25276, laboratorní vyvinuté), a 1:1000 myši antisynaptophysin (Sigma-Aldrich S5768). Sekce byly ošetřeny vhodnou myší nebo králičí HRP konjugovanou sekundární protilátkou dodanou soupravou a vizualizovány pomocí DAB. Sekce byly hematoxylinem kontrastovány, dehydratovány a pokryty Permontem (Fisher Scientific). Sekce byly digitálně skenovány pomocí Mirax SCAN pro analýzu (Zeiss, Don Mills, ON, Kanada). Po deparafinizaci a rehydrataci byly diapozitivy obarveny filtrovaným 1% vodným Thioflavinem-S (Sigma-Aldrich).

Kvantitativní immunohistological analýzy

Iba1-pozitivní buňky v kůře a přední část CA1 oblasti hipokampu byly kvantifikovány pomocí modifikované verze areal počítání frame48. Stručně řečeno, každý pátý snímek byl kvantifikován (což mělo za následek čtyři sekce na mozek). Více ×80 snímků bylo pořízeno skenováním MIRAX v oblasti zájmu a počet buněk pozitivních na Iba1 byl ručně počítán. Byla odhadnuta numerická hustota (počet buněk mm−3) v přední oblasti CA1 a kůře. Pro spolehlivý odhad bylo zapotřebí minimálně 150 zásahů na plochu. Další úseky byly započítány, pokud jsme nebyli schopni dosáhnout našeho minimálního počtu. Kvantifikace byla provedena zaslepeně pro léčbu a genotyp. Software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) byl použit k měření akumulace Aß, GFAP a synaptofyzinového imunopozitivního barvení v oblasti CA1 a kůře. Byly analyzovány čtyři sekce na mozek a v každé sekci bylo pořízeno více snímků k pokrytí oblasti CA1 a kůry. Prahová hodnota byla upravena stejně ve všech mozek pro zvýraznění barevného prostoru, a částice byly analyzovány k určení celkové plochy barvení. Výsledky jsou vyjádřeny jako celková obarvená plocha na celkovou analyzovanou plochu (µm2 mm−2). Reprezentativní obrázky byly oříznuty pouze tak, aby odpovídaly omezením velikosti a nebyly podrobeny žádnému následnému zpracování.

Western blotting

Myš proteinové vzorky (25-100 µg) byly připraveny v Laemmli (5% 2-β-merkaptoethanolu, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Proteasy Inhibitory Koktejl (Sigma-Aldrich)), vařené po dobu 5 min, a oddělené polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE). Vzorky byly sondoval s následující primární protilátky ředěné v 5% odtučněného sušeného mléka v Tris pufru a 0,1% Tween-20 nebo blokujícím pufru PBS (Thermoscientific): 1:1000 mouse anti-human Aß1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 rabbit anti-APP. C-konci (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 rabbit anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 rabbit anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 rabbit anti-Caspase-3 (Buněčné Signalizace 9665), 1:1000 myši antiactive Kaspázy-8 (Buněčné Signalizace 8592), 1:1000 rabbit anti-Caspase-9 (Buněčné Signalizace 9504), a 1:5000 mouse anti β-aktin (Sigma-Aldrich A5441). Skvrny byly detekovány s 1:5000 HRP-linked anti-mouse (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) nebo 1:5000 anti-rabbit (Dako P0217) sekundární protilátka následuje ECL (GE Amersham). Podobná kapely byly vizualizovány pomocí ImageQuant LAS 4000 zobrazovací systém (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), a densitometric analýzy byly provedeny s Image Obrys software pro analýzu (Fujifilm USA). Jas / kontrast surových blotů byly rovnoměrně upraveny v celém obrazu pomocí softwaru Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) pro generování reprezentativních obrázků. Nebyly provedeny žádné další úpravy. Software CanvasTM X (Acd system, Plantation, FL, USA) byl použit k vytvoření konečných čísel. Surové bloty pro západní bloty jsou k dispozici v doplňkovém obrázku 11.

ELISA

Pro – a protizánětlivé cytokiny a hladiny Aß v mozku myší byly stanoveny pomocí elektrochemiluminiscenčních imunitních testovacích souprav z Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Normy a vzorky byly připraveny podle protokolů výrobce a spuštěny ve dvou vyhotoveních. Ten-plex myší prozánětlivý panel byl použit pro myší hipokampální a kortikální a vzorky. K měření myší plazmy byla použita jediná sada Il-1β. Pro vzorky HPN byl použit lidský prozánětlivý panel se čtyřmi plex (viz níže). Čtyřpanelová sada human aß 6E10 byla použita pro myší hipokampus a kůru a vzorky HPN.

RNA extrakci a syntézu cDNA

Celková RNA byla extrahována z myši hipokampu a mozkové kůře (n = 3 v každé skupině) s Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA), následuje homogenizace s 20-gauge jehly. K čištění celkové RNA (Qiagen) byla použita sada miRNeasy mini kit, včetně kroku léčby Dnázou ve sloupci. Kvalita a množství RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produkty byly vizualizovány na RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Kanada) obarvené 2% agarózové gely. Real-time PCR experimenty byly provedeny s SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) na Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systém stroje (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Amplifikace genu byla provedena následujícími primery: (18s) 5′ – GTAACCCGTTGAACCCAT-3 ‚a 5′ – CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3′ a 5′- GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′ – TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3‘ a 5 ‚- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3‘. Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnoty násobné indukce normalizované na střední referenční geny HPRT a 18S pomocí metody Pfaffl.

Myš synaptické plasticity RT2-Profiler PCR array

myši synaptické plasticity RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profily exprese 84 genů zapojených v synaptické změny v učení a paměti a pět housekeeping genů (β-aktin; β-2-mikroglobulin; glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy, GAPDH; β-glukuronidáza, Gusb; Heat shock protein 90 alfa (cytosolic), Hsp90ab1) s PCR v reálném čase. Celková RNA (465 ng pro každý vzorek) byla přepsána reverzní (který zahrnoval genomické DNA eliminační krok) následující výrobce protokol (First Strand cDNA Synthesis Kit, Qiagen). Real-time PCR reakce byla provedena v real-time cycler ABI 7500 (Rychle Zablokovat) (Applied Biosystems) pomocí RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). Cyklistika podmínky byly následující: 2 min při 50 °C, 10 min při 95 °C, 40 cyklů, 15 s každým na 95 °C a 1 min při 60 °C. Prahová hodnota a výchozí hodnota byly nastaveny ručně podle pokynů výrobce. Data byla normalizována na geometrický průměr pěti housekeepingových genů a analyzována srovnávací Ct-metodou (2-ΔCT).

Neuronální buněčné kultury a axonální degenerace test

Dvanáct – šestnáct-týden-staré plodu kortikální tkáně byly získány od Vrozených Vad Research Laboratory (University of Washington, Seattle, USA) v souladu se schváleným protokolem o McGill institucionální review board. HPN byly kultivovány z mozků, které byly disociovány trypsinem, ošetřeny deoxyribonukleázou I a filtrovány přes 130, 70 a 30 µm nylon mesh21. Disociované buňky byly odstředěny po dobu 10 min při 300 x g a resuspendovány v minimální esenciální médium (MEM) s Earlem je solí, doplněný o 5% decomplemented BCS, 1× Penicilin-Streptomycin, 1 mM pyruvát sodný a 2 mM l-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Buňky byly naočkovány v hustotě 3×106 buněk ml-1 na 5 µg mL−1 poly-l-lysinem potažených šestiválcových tkáňových kultivačních destičkách (Sigma-Aldrich). MEM médium bylo měněno každé 2 dny a astrocyte šíření bylo omezeno s fluorodeoxyuridince (FdU) antimitotické léčby (1 mM, Sigma) na první 4 dny. Neuronální kultury byly pěstovány 7-10 dní před provedením experimentů. Byly testovány čtyři různé neuronové přípravky v různých časech. Jeden z neuronových přípravků nebyl stabilní a kultura, včetně kontroly séra+, která nedostala žádný lék, zemřela uprostřed experimentu. Proto byly použity tři různé neuronové přípravky od tří geneticky odlišných dárců.

toxicita VX-765 byla hodnocena pomocí 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT). Neurony byly ošetřeny s 25-200 µM VX-765 nebo 0,1% DMSO (nejvyšší koncentrace DMSO použitý) za 72 h. Neurony byly poté inkubovány s 0,5 µg ml−1 MTT (Sigma-Aldrich) po dobu 4 h při teplotě 37 °C (5% CO2). Formazanové krystaly byly rozpuštěny ve 100 µl DMSO po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena při 560 a 670 nm pomocí čtečky desek Synergy H4.

axonální degenerace byla vyvolána buď transfekcí APPWT, nebo stresem z deprivace séra. VX-765 byl podáván buď jako strategie před léčbou (1 h před stresorem), nebo jako strategie postbeading léčby (48 h po stresoru). Neurony byly transfektovány genem gun (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) se zlatými korálky potaženými pBudCE41-eGFP pro fluorescenční vizualizaci. Neurony, které byly zdůrazněny APPWT, byly transfektovány pomocí pBudCE41-eGFP / APPWT. Krátce byly neurony ošetřeny médiem doplněným 25 nebo 50 µM VX-765, 5 µM inhibitorem Casp1 z-YVAD-fmk nebo DMSO. Fluorescenční snímky byly pořízeny každých 24 h (až do 72 h po expozici) s Nikon Eclipse Ti mikroskopu (Nikon, Mississauga, ON, CA) a Photometrics coolSNAP HQ2 CCD kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) pomocí NIS Elements AR 3.10 software (Nikon). Procento neuronálních korálků bylo měřeno počítáním počtu korálkových egfp-pozitivních neuronů nad celkovým počtem egfp-pozitivních neuronů v každém časovém bodě. Pro každý stav bylo započítáno minimálně 150 neuronů pozitivních na eGFP. Podmíněná střední byla ve vzorku (doplněn 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Proteasy Inhibitory Koktejl (Sigma-Aldrich)), a neurony byly sklizeny v buňce lyzačního pufru (50 mM HEPES, 0.1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) pro analýzu.

Statistické analýzy

počet zvířat nebo nezávislé experimenty a statistické analýzy (ANOVA a post-hoc srovnání), jsou všechny uvedeny v obrázku legendy. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± s. e. m., s hodnotami F A p uvedenými v legendách obrázku. Všechny statistické analýzy byly prováděny pomocí softwaru GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).