Abstrakt

Různé techniky jsou k dispozici pro izolaci Candida v dutině ústní. Takové metody hrají důležitou roli v diagnostice a léčbě orální kandidózy. Rostoucí význam Candidy částečně souvisí se vznikem infekce HIV a rozšířenějším používáním imunosupresivní chemoterapie. Spolu s Candida albicans došlo k většímu uznání významu druhu nonalbicans Candida při orální kandidóze. Identifikace infikujících kmenů Candida je důležitá, protože izoláty druhů Candida se velmi liší, a to jak svou schopností způsobovat infekci, tak také jejich citlivostí na antimykotika. Tento přehled tedy poskytuje přehled spolehlivých metod kandidální izolace a identifikace izolátů z ústní dutiny.

1. Úvod

termín Candida pochází z latinského slova candid, což znamená bílá. Spóry Kandidy jsou komenzální, neškodné formě dimorfní houba, která se stává invazivní a patogenní pseudohyphae, když je porucha v rovnováze flóry nebo při oslabení organismu hostitele .

překlad této endogenní komenzální k onemocnění způsobuje parazit může být spojena s jinými faktory než patogenními atributy organismu sám o sobě, což je poměrně unikátní ve srovnání s většinou jiných infekčních onemocnění, kde virulence organismů považovány za klíčový faktor v patogenezi. Proto jsou druhy Candida přísně oportunistické. Dalo by se říci, že ani povrchní, ani systémové formy infekcí Candida nemohly být zahájeny v nepřítomnosti základní patologie .

Existuje mnoho druhů Candida (Tabulka 1), ale většinou převládá jeden, který se zotavil z ústní dutiny, v obou komenzální státu a v případech, orální kandidóza, je C. albicans. Odhaduje se, že tento druh představuje více než 80% všech izolátů perorálních kvasinek.

v posledních letech byl zvýšený zájem o infekce způsobené oportunním patogenem Candida. Rostoucí význam Candidy částečně souvisí se vznikem infekce HIV a rozšířenějším používáním imunosupresivní chemoterapie . Identifikace infikujících kmenů Candida je důležitá, protože izoláty druhů Candida se velmi liší, a to jak svou schopností způsobovat infekci, tak také jejich citlivostí na antimykotika .

spolu s C. albicans došlo k většímu uznání významu druhu Non-albicans Candida u lidských chorob. C. glabrata A C. krusei jsou druhy, které získaly pozornost vzhledem k jejich zvýšené odolnosti vůči některým antimykotikům. C. dubliniensis je nedávno identifikovaný patogenní druh, poprvé popsaný v roce 1995, kdy byl koizolován S C. albicans z případů orální kandidózy u jedinců infikovaných HIV .

Tento přehled poskytuje přehled spolehlivých metod kandidální izolace a identifikace izolátů z ústní dutiny.

2. Patogenní Atributy Candida

přechod Candida od neškodný komenzální na patogenní organismus je komplexní a souvisí s jemné změny životního prostředí, které vedou k expresi řady faktorů virulence (Tabulka 2). Jedná se o kombinovaný účinek jak hostitelských, tak kandidálních faktorů, které nakonec přispívají k rozvoji orální kandidózy .

bez Ohledu na typ candidosis, schopnost Candida přetrvávat na slizniční povrchy zdravých jedinců je důležitým faktorem, který přispívá k jeho virulence. To je zvláště důležité v ústní dutině, kde organismus musí odolat mechanickému promývacímu působení relativně konstantního toku slin směrem k jícnu .

Ne jeden dominantní faktor virulence Candida je uznáván i když existuje řada faktorů, které byly zapojeny v podpoře procesu infekce. Patří mezi ně atributy podílejí na adhezi Candida ústní povrchy (např. relativní povrchová hydrofobicita a přítomnost specifických adhesin molekuly), schopnost odolávat hostitele imunitní obranné mechanismy (např. vysoké frekvence fenotypové přepínání a morfologické přechodu), a uvolnění hydrolytických enzymů (např., vylučované aspartyl proteinázy a fosfolipázy), které mohou indukovat poškození hostitelských buněk .

3. Orální Kandidóza

Samaranayake navrhovaná klasifikace, kde orální kandidóza léze byly rozděleny do dvou hlavních skupin: Skupina I, nebo primární ústní candidoses omezena na léze lokalizované do ústní dutiny bez zapojení kůže nebo jiných mucosae; Skupina II nebo sekundární ústní candidoses, kde léze jsou přítomny v ústní i extraorální lokalit, jako je kůže (Tabulka 3). Skupina I léze se skládají z klasické triády—pseudomembranózní, erytematózní, a hyperplastických varianty—a někteří navrhli další členění druhé do plaku a tvárné typy .

4. Diagnostika Orální Kandidóza

Diagnóza orální kandidóza může být často provedeno na povahu klinické prezentaci funkcí, i když mikrobiologické vzorky by měly být odebrány, pokud je to možné s cílem identifikovat a kvantifikovat jakýkoli Candida, které mohou být přítomny a poskytnout izolátů pro antifungální testování citlivosti.

5. Metody Izolace

Techniky jsou k dispozici pro izolaci Candida v dutině ústní zahrnují použití nátěru, prostý tamponem , otisk kultury , kolekce celá sliny , koncentrovaná ústní máchání , a slizniční biopsie. Každá metoda má zvláštní výhody a nevýhody a volba techniky odběru vzorků se primárně řídí povahou léze, která má být zkoumána (Tabulka 4). Tam, kde je zřejmá přístupná a definovaná léze, je často preferován přímý přístup k odběru vzorků, jako je použití tamponu nebo otisku, protože to poskytne informace o organismech přítomných na samotné lézi. V případech, kdy nejsou žádné zjevné léze nebo v případech, kdy je léze obtížně přístupná, je přijatelnější nepřímý vzorek založený na kultivaci vzorků slin nebo ústní výplach.

Kvantitativní odhad plísňové zátěže může být provedeno pomocí potisku, koncentrovaná ústní opláchněte a kultivace ústní máchání, jako prostředek rozlišování mezi komenzální kočár a patogenní existenci ústní Candida, s vyšší zatížení považováno za pravděpodobné, že v druhé .

6. Přímá mikroskopie

morfologické znaky druhu Candida (Tabulka 5) musí být zkoumány pro identifikaci. Nátěr má hodnotu při rozlišování mezi kvasinkami a hyfálními formami, ale je méně citlivý než kulturní metody . Příprava vzorku hydroxidu draselného (KOH) odhaluje nepigmentované septátové hyfy s charakteristickým dichotomickým větvením (pod úhlem přibližně 45°). V Koh-Calcofluor fluorescenční barvicí metodě budou houbové vlastnosti, jako jsou hyfy, kvasinkové buňky a další houbové prvky, fluoreskovat .

stěr převzaty z lesional místě je stanovena na sklíčka a poté se obarví buď gramovo barvení nebo periodické acid Schiff (PAS) technika. Při použití těchto metod se kandidální hyfy a kvasinky objevují buď tmavě modré (gramové skvrny) nebo červené / fialové (PAS).

V případě, že chronická hyperplastická kandidóza, biopsie z léze je nutné pro následné detekce invaze Candida histologické barvení pomocí PAS nebo Gomori je methenamin stříbrné skvrny. Demonstrace houbových prvků v tkáních se provádí, protože jsou hluboce barveny těmito skvrnami. Přítomnost blastospor a hyfy nebo pseudohyphae může povolit histopathologist identifikovat jako houba druhy Candida a vzhledem k přítomnosti jiných histopatologické rysy, diagnózu chronická hyperplastická kandidóza .

7. Laboratorní kultura

7.1. Výtěr

výtěr z místa léze je relativně jednoduchá metoda detekce růstu a lze získat semikvantitativní odhad Candidy. Výběrové šetření zahrnuje jemně třít sterilní vatový tampon přes lesional tkáně a následně inokulovat primární izolační médium, jako Sabouraud je dextróza agar (SDA) .

7.2. Koncentrovaná Ústní Máchání

ústní máchání technika zahrnuje pacient drží 10 mL sterilního fosfátového pufru (0,01 M, pH 7,2) v ústech po dobu 1 minuty. Řešení je pak soustředěna (10-fold) odstředěním a známého objemu, obvykle 50 µL, naočkovány na agarové médium, pomocí spirály pokovování systému. Po 24-48 hodinách inkubace při 37°C se růst hodnotí výčtem kolonií a vyjadřuje se jako jednotky tvořící kandidální kolonie na mL (cfu mL−1) máchání .

7.3. Impresní Kultura

metoda potisku využívá sterilní pěnovou podložku známé velikosti (typicky 2,5 cm2), předem namočenou ve vhodném kapalném médiu, jako je Sabouraudův vývar, bezprostředně před použitím. Podložka se poté umístí na cílové místo (sliznice nebo intraorální protéza) po dobu 30 sekund a poté se přenese do agaru pro kultivaci .

8. Kultivační Média

nejčastěji používané primární izolační médium pro Candida je SDA, která, ačkoli umožňující růst Candida, potlačuje růst mnoha druhů ústní bakterie vzhledem ke své nízké hodnotě pH. Zařazení antibiotik do SDA bude další zvýšení jeho selektivity . Typicky se SDA inkubuje aerobně při 37°C po dobu 24-48 hodin. Candida se vyvíjí jako krémová, hladká, pastovitá konvexní kolonie na SDA a diferenciace mezi druhy je zřídka možná . Odhaduje se, že více než jeden druh Candida se vyskytuje v přibližně 10% orálních vzorků a v posledních letech je stále důležitější schopnost detekovat druhy nonalbicans.

v posledních letech byla vyvinuta další diferenciální média, která umožňují identifikaci určitých druhů Candida na základě vzhledu a barvy kolonie po primární kultuře. Výhodou takového média je, že lze určit přítomnost více druhů Candida v jedné infekci, což může být důležité při výběru následných možností léčby . Příklady těchto zahrnují Pagano-Levinův agar nebo komerčně dostupné chromogenní lze testovat kolonie, a to, CHROMagar Candida Albicans ID, Fluroplate, nebo Candichrom albicans .

Pagano-Levin agar rozlišuje mezi druhy Candida na základě redukce trifenyltetrazoliumchloridu. Médium produkuje bledě zbarvené kolonie C. albicans, zatímco kolonie jiných druhů Candida vykazují různé stupně růžového zbarvení. Pagano-Levin agar má podobnou citlivost jako SDA, ale je lepší pro detekci více než jednoho druhu ve vzorku, CHROMagar Candida identifikuje C. albicans, C. tropicalis a C. krusei na základě barvy a vzhledu kolonie, zatímco Albicans ID a Fluroplate se ukázaly jako prospěšné pro předpokládanou identifikaci C. albicans . Uvádí se, že specificita identifikace je 95% pro CHROMagar Candida a 98,6% pro Albicans ID a Fluroplate agary . Použití CHROMagar Candida jako primárního izolačního agaru bylo citováno jako přístup, který umožňuje diskriminaci nově popsaného C. dubliniensis od C. albicans. Na CHROMagar Candida se C. dubliniensis údajně vyvíjí jako tmavší zelené kolonie ve srovnání s koloniemi C. albicans . Zdá se však, že diskriminace mezi těmito dvěma druhy pomocí Chromagaru klesá při subkultuře a skladování izolátů. Selhání C. dubliniensis růst na agaru média při zvýšené kultivační teplotě 45°C byl nedávno navrhl jako alternativní test k odlišení těchto dvou druhů .

9. Identifikace Candida Druhů,

Identifikace kvasinek založené na primární kultura média může být potvrzena prostřednictvím různých doplňkové testy tradičně založena na morfologické (Tabulka 5) a fyziologické vlastnosti izolátů.

9.1. Morfologická kritéria

test zárodečné zkumavky je standardní laboratorní metodou pro identifikaci C. albicans. Test zahrnuje indukci hyfálních výrůstků (zárodečných zkumavek), pokud jsou subkultivovány v koňském séru při 37°C po dobu 2-4 hodin. Přibližně 95% izolátů C. albicans produkují zárodečné trubky, vlastnost sdílí i. C. stellatoidea a C. dubliniensis .

C. albicans a C. dubliniensis lze také identifikovat od jiných druhů na základě jejich schopnosti produkovat morfologické rysy známé jako chlamydospory. Chlamydospory jsou refraktilní, sférické struktury generované na terminách hyf po kultuře izolátů na nutričně chudém médiu, jako je kukuřičný agar. Izoláty jsou naočkovány křížovým poklopem na agaru a překryty sterilním krycím sklem. Agary se inkubují po dobu 24-48 hodin při 37°C a poté se mikroskopicky vyšetřují na přítomnost chlamydosporů .

9.2. Fyziologická kritéria / biochemická identifikace

biochemická identifikace druhů Candida je do značné míry založena na využití uhlohydrátů. Tradiční testování by zahrnovalo kulturu zkušebních izolátů na bazálním agaru bez zdroje uhlíku. Sacharidové roztoky by pak byly umístěny do jamek naočkovaného agaru nebo na disky filtračního papíru umístěné na povrchu agaru. Růst v blízkosti zdroje uhlíku by naznačoval využití. Komerční systémy jsou založeny na stejném principu, ale testovací sacharidy jsou uloženy v plastových jamkách umístěných na testovacím proužku. Růst v každé jamce je čten změnami zákalu nebo změnami barev v určitých systémech soupravy. Číselné kódy získané z výsledků zkoušek se používají k identifikaci testovaného organismu na základě porovnání databáze .

9.3. Sérologie

sérologické testy se často používají ke zjištění klinického významu izolátů druhu Candida. Zvyšující se titry lgG protilátek proti C. albicans mohou odrážet invazivní kandidózu u imunokompetentních jedinců. Detekce protilátek IgA a IgM je důležitá pro identifikaci akutní infekce. Imunosuprimovaní jedinci často vykazují variabilitu tvorby protilátek a v takovém případě se doporučuje použít test detekce antigenu. Testy, jako je enzym linked immunosorbent assay (ELISA) a radio immuno assay (RIA) pro detekci candidial antigen, a to buď buňky-zdi, mannan nebo cytoplazmatické složky jsou nyní k dispozici ve vyspělých zemích .

sérologická diagnóza je často zpožděna a testy stále postrádají citlivost a specificitu. Kromě toho je produkce protilátek u imunokompromitovaných pacientů variabilní, což komplikuje diagnózu . To je vzhledem k tomu, že houbové antigeny a metabolity jsou často vymazány rychle z oběhu a přítomnost protilátek nemusí vždy znamenat Candida infekce, zejména u pacientů se závažným základním onemocněním, nebo kteří užívají imunosupresivní léky .

sérologické testy obvykle nejsou diagnostickým nástrojem pro orální kandidózu. Takové testy však mohou být prognostickým nástrojem u pacientů s těžkou orální kandidózou, kteří špatně reagují na antimykotickou léčbu .

9.4. Molekulární identifikační metody

identifikace analýzou genetické variability je stabilnější přístup než použití metod založených na fenotypových kritériích. Pro identifikaci Candida na základě genetické variace jsou elektroforetické analýzy karyotypu rozdíly a mnohotvárnost délky fragmentu (RFLPs) pomocí gelové elektroforézy nebo DNA-DNA hybridizace .

druhově specifické PCR přístupy byly také použity pro identifikaci druhů Candida. Několik cílových genů bylo hlášeno pro diskriminaci druhů Candida, ačkoli nejčastěji amplifikované jsou sekvence ribozomálního RNA operonu. Identifikaci lze získat na základě PCR produkt velikosti získané po gelové elektroforézy rozlišení, nebo produktu PCR sekvence variace určuje buď podle přímé sekvenování nebo pomocí restrikčních fragmentů analýza následující dělení PCR sekvence s restriction endonucleases .

Fluorescenční in situ hybridizace s peptidové nukleové kyseliny metodou (PNA Fish) je nový detekční technika, která se zaměřuje na vysoce zachována druhově specifické sekvence v hojné rRNA bydlení C. albicans. Jednotlivé buňky mohou být detekovány přímo bez nutnosti amplifikace . Tato technika dosahuje citlivosti 98.7–100%, specifičnost 100%, což pro diskriminaci z C. albicans od fenotypově podobné C. dubliniensis .

na Molekulární bázi technologie může být také použita k identifikaci kmenů Candida druhů, ačkoli použití technik, jako je Pulsní Pole Gelová Elektroforéza (PFGE), Náhodně Amplifikované Polymorfní DNA (RAPD) analýzy, a opakujte pořadí amplifikace PCR (REP) jsou z velké části vyhrazena pro epidemiologické šetření ve výzkumu orální kandidóza .

10. Závěr

v posledních letech byl kladen větší důraz na spolehlivou identifikaci druhů Candida z klinických vzorků u lidí. Schematické znázornění kandidální izolace a identifikace je znázorněno na obrázku 1. Vzhledem k tomu, že Candida je rezidentní mikroflóra, jsou nutné vhodné izolační metody, aby se zjistila přítomnost v ústech spolu s jejich počtem. Je také důležité identifikovat napadení kmenů Candida, protože izolátů Candida druhy se liší široce, a to jak v jejich schopnost způsobit infekci a také v jejich citlivosti na antimykotika. Různé fenotypové techniky jsou k dispozici pro identifikaci izolovaných Candida, včetně pomocí morfologické kultura testy, differential agar média, a biochemické asimilace testy. Tyto metody jsou doplněny nedávnými molekulárními technikami z velké části vyhrazenými pro epidemiologická vyšetřování.

Obrázek 1

Schematické znázornění izolace a identifikace Candida druhů, z ústní dutiny.