Výsledky
ALDH1 Exprese v Embryonálních a Dospělých Slinivky břišní.
na Základě předchozí studie, dokumentující vysoké úrovně ALDH1 enzymatické aktivity v nervové, krvetvorné a prsních epiteliálních kmenových buněk (17-19), jsme se vyznačuje časové a prostorové vzory ALDH1 proteinové exprese v embryonálních a dospělých myší slinivky břišní (Obr. 1). Pomocí E-cadherin jako marker slinivky břišní, epitelové buňky, zjistili jsme, že ALDH1 protein je první detekovatelné v rozvojových slinivky břišní epitelu na E12.5 (Obr. 1A). V tomto bodě, výraz je omezen na špičky větvení kanálků, nedávno navrhla představují multipotential předek domény (20). Podobný vzorec exprese byl dříve hlášen pro aldh1a1 transkripty (21). Exprese v trubkových špičkách (a nikoli v centrálních kmenech) přetrvává přes E14. 5 (obr. 1 B a B‘), a je následně down-regulován v diferenciaci acinárních buněk. U dospělých pankreatu je epiteliální exprese ALDH1 nejčastěji pozorována v centroacinárních a terminálních duktálních epiteliálních buňkách (obr. 1 PÍSM. E). Byly také detekovány mezenchymální (e-kadherin-negativní) buňky exprimující ALDH1 obklopující endokrinní ostrůvky a exokrinní aciny (obr. S1).
exprese ALDH1 v embryonálním a dospělém myším pankreatu. (A–C) Immunofluorescent označení pro ALDH1 bílkovin (zelená) v kombinaci s E-cadherinu (červená) označit epiteliálních struktur v E12.5 (A), E14.5 (B a B‘), a dospělé myši slinivky břišní (C). Obrázek v (B‘) představuje větší zvětšení plochy označené rámečkem v (B). Poznámka: omezení exprese ALDH1 na špičky epiteliálních větví (označené hvězdičkami v B‘) a ne více – centrální kmeny větví(označené hvězdou). U dospělých slinivky břišní (C) je exprese ALDH1 omezena na podskupinu centroacinárních buněk pozitivních na E-kadherin. (D a E) Imunohistochemická detekce ALDH1 bílkovin (hnědá) v podskupin centroacinar (šipky) a svorkou potrubí buněk (šipky). (Stupnice: 50 µM.)
dále charakterizovat ALDH1 projevu a ALDH1 enzymatické aktivity u dospělých terminálu potrubí/centroacinar buněk, jsme použili přípravky z periferní acinární-duktální jednotky čerstvě izolované z kolagenázy-stravitelné myši exokrinní pankreas (22). Důležité je, že tyto izolované periferní acinární-duktální jednotky jsou značně vyčerpané velké potrubí a endokrinní prvky. Ve srovnání s celkovou slinivky břišní, periferní acinární-duktální jednotky vystavoval >400-krát vyčerpání v inzulínu přepisy, jak je hodnocena pomocí RT-PCR (Obr. S2A). Když FACS analýza byla provedena na periferní acinární-duktální jednotky sklizené z transgenních Ins1:DsRed myší exprimujících červený fluorescenční protein v β-buňkách, pouze 3 z 10 000 buněk (0.03%) z této přípravě byly pozitivní pro DsRed.
Další trojrozměrná charakterizace exprese proteinu ALDH1 byla provedena pomocí fluorescenčního značení izolovaných periferních acinar-duktálních jednotek. ALDH1 protein byl lokalizován v kombinaci s E-cadherin jako marker epiteliálních buněk, a buď s FITC-konjugované Dolichos biflorus agglutinin (DBA) nebo FITC-konjugované arašídové agglutinin (PNA), markery duktální a acinární buňky, respektive. Vícekanálové zobrazování potvrdilo převážně centroacinární / terminální duktální umístění epiteliálních buněk exprimujících ALDH1 v dospělém pankreatu (obr. Galaxie). Buňky exprimující ALDH1 byly nejčastěji vloženy mezi terminální duktální epitel a perifernější acinární buňky. Kromě toho byly také pozorovány jednotlivé epiteliální buňky exprimující ALDH1 bezprostředně sousedící s terminálním duktálním epitelem (obr. S3 A A B). Byly identifikovány jak DBA-pozitivní, tak DBA-negativní ALDH1-pozitivní buňky, zatímco ALDH1-pozitivní PNA-pozitivní buňky byly identifikovány pouze zřídka.
izolace CENTROACINÁRNÍCH a terminálních duktálních buněk exprimujících ALDH1.
V naději, že izolace ALDH1-exprimujících buněk z dospělé myši slinivky břišní, využili jsme fluorogenic substrát známý jako „Aldefluor“ (StemCell Technologies), který byl již dříve použit ve FACS-izolace systémem pro krvetvorbu, nervové, a prsní epiteliální kmenové buňky (17-19). Před pokusem o izolaci pankreatických epiteliálních buněk exprimujících ALDH1 na bázi FACS jsme nejprve použili toto činidlo k vizualizaci živých buněk exprimujících ALDH1 v periferních acinárních duktálních jednotkách (obr. 2). Jak je znázorněno na obr. 2 E A F, tyto studie potvrdily centroacinární / terminální duktální lokalizaci buněk pozitivních na Aldefluor s nízkou hojností v pankreatu dospělých myší. Aldefluor-pozitivní centroacinární / terminální duktální buňky byly snadno odlišeny od sousedních acinárních buněk díky jejich malé velikosti a nedostatku granulí zymogenu. Další příklady zobrazování živých buněk pomocí činidla Aldefluor jsou uvedeny na obr. S4. Tato zjištění naznačila, že anti-ALDH1 imunofluorescence a Aldefluor na bázi cytofluorescence bylo označení podobné centroacinar/terminal ductal populace, a dále navrhl, že tyto buňky by mohly být úspěšně izolován pomocí FACS.
FACS izolace CENTROACINÁRNÍCH/terminálních duktálních epiteliálních buněk exprimujících ALDH1 pomocí činidla Aldefluor. Třídění FACS bylo provedeno na jednotlivých buňkách izolovaných z periferních acinar-duktálních jednotek vyčerpaných endokrinními a velkými kanálovými prvky. (A A B) bránění buněk pozitivních na Aldefluor na základě enzymatické aktivity aldh1 citlivé na DEAB. osa y označuje boční rozptyl; osa x označuje intenzitu aldefluorového signálu (a) s a (B) bez DEAB. (B a C) Detekce ALDH1 enzymatické aktivity (C) a (D) bez DEAB, ve spojení s povrch průkaz E-cadherinu bílkovin. osa y představuje intenzitu značení anti-e-kadherinovou protilátkou konjugovanou s APC; osa x označuje intenzitu aldefluorového signálu. FACS-řazeny populace indikována P2, P3, P4, a P5 v D odpovídají Aldefluor-pozitivních, E-cadherin-negativní (A+E−), Aldefluor-pozitivních, E-cadherin-pozitivní (A+E+), Aldefluor-negativní, E-cadherin-pozitivní (A−E+), a Aldefluor-negativní, E-cadherin-negativní (−E−), resp. (E a F) Zobrazování kolagenázy-stravitelné myši slinivky břišní pomocí Aldefluor činidla potvrzuje centroacinar/terminal ductal lokalizace Aldefluor-pozitivní buňky, podobné té, která je pozorována pro ALDH1 imunofluorescence (Obr. 1 a 2). Poznámka centroacinar/terminal ductal poloze a malé velikosti Aldefluor-pozitivní buňky, vzhledem k větší acinární buňky, které jsou snadno identifikovatelné podle granulární cytoplazmou odpovídající apikální zymogen granule. (Stupnice: 50 µM.) G) kvantitativní RT-PCR analýza genové exprese v A+E+ buňkách (červené), a+E-buňkách (bílé), a+E− buňkách (modré) a A−E− buňkách (černé). Ve srovnání s−E+ aldefluor-negativní epitelové buňky, A+E+ aldefluor-pozitivní centroacinar/terminal ductal epiteliálních buněk, jsou obohaceny o přepisy kódování Aldh1a1, Aldh1a7, Sca1, Sdf1, c-Met, Nestinu, Ptf1a, a Sox9. (Stupnice: 50 µM.)
tvorba, diferenciace a funkce pankreatosfér odvozených z aldefluor-pozitivních centroacinárních / terminálních duktálních buněk. (A A B) A+E+ centroacinární / terminální duktální epiteliální buňky, ale ne a-E+ epiteliální buňky, účinně tvoří pankreatosféry v suspenzní kultuře. (C–G), Exprese E-cadherinu (C), inzulínu, C-peptidu (D), amylázy (E), Sox9 (F), a ALDH1 (G) v den 7 pancreatospheres tvořen z+E+ centroacinar/terminal ductal epiteliálních buněk. (H) proliferaci Buněk v den 7 pancreatospheres hodnoceno přes noc inkorporace EdU přidáno 6. den kultury období. I) test založený na ELISA uloženého a vylučovaného inzulinového C-peptidu po inkubaci pankreatosfér nebo buněk Ins-1 přes noc v různých koncentracích glukózy. Všimněte si, že pankreatosféry vykazují citlivost na glukózu podobnou citlivosti pozorované v buňkách Ins-1 (tj., ∼2-násobné zvýšení sekretovaného C-peptidu v reakci na 0 vs. 11 mM glukózu). (Stupnice: 100 µM.)
další sledované FACS-na základě charakterizace a třídění jednotlivých buněk izolované z periferní acinární-duktální jednotek. Jako počáteční prostředek pro stanovení specifické brány buněk exprimujících ALDH1 jsme použili farmakologický inhibitor enzymatické aktivity ALDH1 (DEAB). Jak je znázorněno na obr. 2 A-D, tato strategie umožnila izolaci buněčné populace s nízkou hojností charakterizované vysokými hladinami enzymatické aktivity aldh1 citlivé na DEAB, obsahující 0,9% ± 0.2% všech tříděných buněk v pankreatu dospělých myší. Pomocí E-cadherin protilátek současně identifikovat epitelové buňky, Aldefluor (+) E-cadherinu (+) buněk bylo zjištěno, že představují 0.5% ± 0.13% všechny řazeny buněk v dospělé myši slinivky břišní (Obr. 2D).
Pomocí kvantitativní RT-PCR porovnat Aldefluor-pozitivních, E-cadherin-pozitivní (A+E+), Aldefluor-negativní, E-cadherin-pozitivní (A−E+), Aldefluor-pozitivních, E-cadherin-negativní (A+E−), a Aldefluor-negativní, E-cadherin-negativní (−E−) populace izolované z dospělých myší slinivky břišní, našli jsme+E+ populace bude výrazně obohacen o přepisy kódování Aldh1a1 a Aldh1a7, a vyčerpané přepisy pro další dva ALDH1 izoformy, Aldh1a2 a Aldh1a3 (Obr. 3G). Aldh8a1 nebyl detekován v žádném ze vzorků. Ve srovnání s S−E+ populace, A+E+ buňky byly mírně vyčerpané přepisy pro Pdx1 (P < 0.09), Amylázy (P < 0, 001) a Cytokeratinu-19 (P < 0.01) (markery vyjádřeny v diferencované β-buněk, acinární buňky, a potrubí buňky, v tomto pořadí). V kontrastu, A+E+ buňky byly charakterizovány na vysoké úrovni exprese Ptf1a, navzdory tomu, že byly vyčerpány obou Amylázy přepisy a amylázy proteinu (Obr. 3G a obr. S5). Kromě toho, tyto buňky jsou obohaceny o přepisy kódování Sca-1, SDF1, c-Met, Nestinu, Sox9, Hey1, a Hey2, fixy dříve spojené s progenitorových populací ve slinivce břišní a jiných tkáních. Pomocí immunofluorescent označení na cytospin preps pro FACS-řazeny buněk, jsme potvrdili, označené obohacení pro ALDH1 a Sox9 bílkovin, a vylučování amylázy v+E+ buněk (Obr. S5). Kromě toho, jsme také provádí FACS analýzy určit frekvenci, s níž Aldefluor (+) buněk byly také pozitivní na markery kmenových buněk jako je CD133 a Sca-1 protein, a poznamenal, že více než 90% Aldefluor (+) buněk navíc coexpressed oba tyto markery kmenových buněk. V kontrastu, pouze 0,11% Aldefluor (+) buněk byly také pozitivní pro vaskulární endoteliální marker PECAM, vzhledem k tomu, že 0.08% bylo pozitivních na marker hematopoetických průkazu cd45. Když FACS analýza byla provedena na periferní acinární-duktální jednotky sklizené z transgenních Ins1-DsRed myší exprimujících červený fluorescenční protein v β-buňkách, všechny Aldefluor (+) buněk bylo zjištěno, že negativní pro dsRed.
Pankreatosférický test endokrinní a exokrinní progenitorové funkce.
Jako počáteční obrazovku pro předek-jako činnost, jsme testovány Aldefluor (+) a Aldefluor (–) buněk pro schopnost tvořit pancreatospheres (Obr. 3), podobně jako test neurosféry běžně používaný k identifikaci nervových progenitorů (23). V těchto testech byly A+ E + centroacinární / terminální duktální buňky jedinečně schopné tvořit koule v suspenzní kultuře. Buňky a+ E + vykazovaly účinnost formování koule >100krát vyšší než jejich protějšky A−E+ (obr. 3 A A B a tabulka S1). S nižší účinností, dělená A+E+ buňky byly dokonce schopni tvořit koule, když á v klonální hustota (jedna buňka na jamku) v 96jamkových destičkách (Tabulky S1). Ani jedna z populací negativních na E-kadherin nevykazovala významnou schopnost formovat sféru. Při kultivaci po dobu 5 až 7 dnů vykazovaly pankreatosféry odvozené z buněk a+E+ silnou expresi E-kadherinu (obr. 3C), potvrzující jejich epiteliální identitu a jednotlivé buňky uvnitř koulí začaly hromadit značné množství amylázy nebo inzulínu a inzulínu C-peptidu (obr. 3 D A E). Po 5 dnech vykazovalo ≈50% pankreatosfér expresi amylázy, zatímco přibližně 30% vykazovalo imunoreaktivitu na inzulín C-peptid. Jednotlivé sféry byly obecně pozitivní na inzulín nebo amylázu, ale ne na obě. Malé podmnožiny buněk ve sférách udržovaly expresi ALDH1 během kultivačního období a také prokázaly jadernou expresi proteinu Sox9 (obr. 3 F A G), což naznačuje možnou údržbu samoobnovujícího fondu progenitorů. Tato zdánlivá schopnost sebeobnovy byla dále podpořena faktem, že pancreatospheres generované Aldefluor (+) centroacinar/svorka duktální buňky by mohly být vystaveny sériové enzymatické disociace, zachování jejich sféra-tvoří kapacitou přes minimálně tři sekvenční pasáže v 7-denních intervalech. Kromě toho byly buňky ve sférách vysoce proliferativní, jak bylo hodnoceno nočním začleněním EdU přidaného buď na začátku nebo na konci kultivačního období (obr. 3H).
Na základě odlišných kapacit progenitorů zobrazených buňkami a + E+ jsme dále zkoumali tříděné buněčné populace pro expresi Ngn3, markeru endokrinních progenitorových buněk (obr. S2B). V souladu s předchozími studiemi (7), jsme byli schopni detekovat významné výraz Ngn3 v celkové dospělé slinivky břišní nebo některou z čerstvě řazeny buněčných populací. Nicméně, jakmile A+E+ buňky byly umístěny v kultuře, začali vytvářet detekovatelné exprese Ngn3, které bezprostředně předchází nástupu inzulínu projevu, dále potvrzení endokrinního předek kapacita ALDH1-vyjádření centroacinar a terminal ductal epiteliálních buněk.
Pancreatospheres Odvozen od Aldefluor (+) Terminálu Duktální/Centroacinar Buňky Zobrazení Glukózy-Citlivý Sekreci Inzulínu.
detekce buněk exprimujících inzulínu a inzulínu, C-peptidu v kultivované pancreatospheres vyzváni posouzení, zda tyto buňky byly schopné z glukózy-citlivý sekrece inzulínu, charakteristický funkčních β-buněk. Jako pozitivní kontrolu jsme použili In-1 buněk (klon 832/13) zvěčněn β-buňky, řádku, běžně používaných pro studium sekrece inzulínu v odpovědi na fyziologické koncentrace glukózy v krvi. Po jednodenní inkubaci buď pancreatospheres nebo In-1 buněk v 0, 5, a 11 mM glukóza, a to jak kultivační média supernatanty a buněčné lyzáty byly sklizeny a analyzovány pro vylučován a mobilní inzulínu, C-peptidu pomocí ELISA založené na testu. Pancreatospheres odvozen od Aldefluor (+) centroacinar/svorka duktálních buněk vylučován C-peptidu v glukózo-dependentní způsobem, s glukózy, citlivost, podobný zobrazena In-1 buněk (Obr. 3I).
Aldefluor ( + ) dospělé terminální duktální / Centroacinární buňky mohou přispívat k embryonálním endokrinním a exokrinním liniím.
Jako ještě přísnější test pankreatické předek činnost, jsme microinjected izolované Aldefluor (+) a Aldefluor (–) buněk do microdissected hřbetní slinivky břišní pupeny izolované z E12.5 myší embrya, a testovány na schopnost produktivně přispívat k rozvoji endokrinní a exokrinní linií (Obr. 4). Tento přístup byl nedávno použit k dokumentaci progenitorové aktivity pro buňky exprimující Ngn3 vznikající po ligaci pankreatického kanálu (7). Vystopovat linie dospělé-odvozené dárce buňky a odlišit je od jejich embrya-odvozené protějšky, izolovali jsme Aldefluor (+) a Aldefluor (–) buněk ze slinivky břišní myší nesoucí všude vyjádřil pCAG:mCherry transgenu, jak je schematicky znázorněno na Obr. 4A (pcag: mcherry myši byly laskavě poskytnuty Michaelem Wolfgangem, Johns Hopkins University). Při srovnání s Aldefluor (–) buňkách, Aldefluor (+) buněk provádí výrazně zvyšuje potenciál přispět k rozvíjející endokrinní linií v rámci zrání hřbetní pupeny, o čemž svědčí coexpression mCherry buď s C-peptidu (Obr. 4 B-E) nebo glukagon (obr. 4 F–I). Pomocí položený E-cadherin značení umožňující počítání jednotlivých mCherry-pozitivní buňky jsme kvantitativně hodnocena schopnost dospělých Aldefluor (+) a Aldefluor (−) buňky vstupují do zárodečných linií. Sedm dní po mikroinjekci buněk Aldefluoru (+) do E12.5 hřbetní pupeny, exprese glukagonu byla pozorována u 11,7% reziduálních mcherry pozitivních buněk, s expresí inzulínu C-peptidu pozorovanou u dalších 11,6% (obr. 5N). V kontrastu, 2,4% zbytkové mCherry-pozitivní Aldefluor (−) buňkách vyjádřil glukagon, a pouze 0,2%, vyjádřeno inzulínu C-peptidu. Zajímavé je, že Aldefluor (+) a Aldefluor (–) populací zobrazí ekvivalentní schopnosti vstoupit do nonendocrine epiteliálních linií, možná to odráží skutečnost, že většina Aldefluor (–) obyvatelstvo tvořilo již diferencovaný acinární buňky. Podobné frekvence E-cadherinu, amylázy a PNA pozitivity byly pozorovány v reziduální mCherry-pozitivní buňky odvozené buď od Aldefluor (+) nebo Aldefluor (–) populací (Obr. 4 J-N).
aldefluor-pozitivní dospělé pankreatické buňky vstupují do endokrinních i exokrinních linií v kultivovaném embryonálním pankreatu. (A) schéma experimentu. Sledovat linie z dospělé buňky, Aldefluor (+) a Aldefluor (–) buňky byly izolovány z dospělého CAG:mCherry transgenní myši slinivky břišní, microinjected do microdissected hřbetní slinivky břišní pupeny izolované z E12.5 netransgenní myší embrya a testována pro schopnost produktivně přispívat k rozvoji endokrinních a exokrinních linií. (B–J) Coexpression mCherry a inzulínu, C-peptidu (Být) a mCherry a glukagon (F–I) potvrzuje, kapacita dospělých Aldefluor (+) buněk přispět k embryonálních β – a α-buněk linie, vzhledem k tomu, že označování jednotlivých mCherry-pozitivní buňky s FITC-konjugované PNA (J–M) potvrzuje schopnost přispět k embryonálních acinární linie. (N) Frekvence, s níž zbytkové mCherry-pozitivních dospělých Aldeflouor (+) a Aldefluor (−) buňkách štítek na inzulínu, C-peptidu, glukagonu, E-cadherin, a PNA 7 dnů po mikroinjekce do microdissected E12.5 hřbetní pankreatické buňky. Všechny počty buněk byly stanoveny pomocí značení E-cadherinem k nastínění hranice jednotlivých buněk. Všimněte si, že kapacita endokrinní diferenciace je převážně omezena na populaci Aldefluoru ( + ), zatímco buňky Aldefluoru (+) i aldefluoru (−) mohou produktivně přispívat k rozvoji exokrinních linií. (Stupnice: 50 µM.)
expanze centroacinárních a terminálních duktálních epiteliálních buněk exprimujících ALDH1 v prostředí chronického zánětu a regenerativní epiteliální metaplazie. Následující antigen retrieval, ALDH1 protein byl detekován pomocí imunohistochemie na pankreatické tkáně od normálního dospělého pankreatu (a, B) a slinivky břišní sklizené z myší s chronickou pankreatitidou vyvolané tři týdenní injekce caerulein (C–H). (A A B) nízkofrekvenční značení ALDH1 v terminálních duktálních (TD) epiteliálních buňkách z normálního dospělého pankreatu. (C and D) Expansion of ALDH1-expressing terminal ductal epithelium following sequential caerulein administration. (E and F) Similar expansion of ALDH1-expressing centroacinar cells (CAC) following sequential caerulein administration. (G and H) Expression of ALDH1 in caerulein-induced metaplastic type 2 (TC2; H), but not type 1 (TC1; G) tubular complexes.
Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.
vyhodnotit in vivo chování ALDH1-vyjádření centroacinar a svorkou potrubí buněk, hodnotili jsme vzory ALDH1 výraz v prostředí chronického zánětu a regenerační metaplazie vyvolané sekvenční podávání nízkých dávek caerulein. Jak již bylo dříve oznámeno (15), léčba dospělých myší s tři injekce caerulein (50 µg/kg) za týden po dobu 3 po sobě jdoucích týdnů vyvolané stavu chronické pankreatitidy následované téměř kompletní regeneraci a opravy. Tento proces se vyznačuje tím, zánětlivých infiltrátů, stromální rozšíření a vzniku regenerační metaplastické tubulární komplexy, které zahrnují typ-1 tubulární komplexů v minulosti ukázal být acinární buňky-odvozeny, a typ-2 trubkové komplexy (TC2), dříve prokázáno, že být nonacinar odvozené a pravděpodobně vznikající z množících se svorkou potrubí buněk (15). Na rozdíl od relativně nízkého množství terminálního kanálu exprimujícího ALDH1 a centroacinárních buněk pozorovaných u normálního dospělého pankreatu (obr. 5 A A B), koncový kanál exprimující ALDH1 (obr. 5 C A D) a centroacinar (obr. 5 E A F) buňky byly výrazně rozšířeny v prostředí chronické pankreatitidy vyvolané kaeruleinem. Je třeba poznamenat, že tubulární komplexy typu 2 byly složeny převážně z buněk exprimujících ALDH1 (obr. 5H), zatímco tubulární komplexy typu 1 nevykazovaly žádný důkaz exprese ALDH1 (obr. 5G).
