Lidská buňka povrch marker, screening

embryonálních kmenových buněk a hPSC-RPE buňky byly odděleny do jednotlivých buněk pomocí TrypLE po dobu 5-10 min. Optické váčky byly odděleny do jednotlivých buněk pomocí TrypLE Vyberte (Gibco, Invitrogen) po dobu 10 min, následuje fyzikální disociační přes 20 G jehly. Umožňují simultánní analýzu těchto různých populací ve stejném vzorku, embryonálních kmenových buněk, hPSC-RPE buňky a očního váčku buňky byly označeny CellTrace™ CFSE (0.25 µM) po dobu 7 min při 37 °C nebo CellTrace™ Violet (5 µM) po dobu 20 min při 37 °C po výrobce protokol (Thermo Fisher Scientific). Poté byly tři typy buněk obarveny pomocí screeningových panelů Bd Lyoplate™ (Bd Biosciences) podle protokolu výrobce. Čárové kódování buněk umožnilo snadno rozlišit mezi třemi skupinami buněk a minimalizovat variabilitu vzorku během screeningu. Vzorky byly analyzovány na 96jamkové desky na LSRFortessa vybaven 405, 640, 488, 355, a 561 nm lasery (BD Biosciences) nebo CytoFLEX vybaven 405, 638, 488, 561 nm lasery (Beckman Coulter). Neživotaschopné buňky byly z analýzy vyloučeny za použití barviva nukleové kyseliny 7-AAD (7-aminoactinomycin D) (Bd Biosciences). Analýza dat byla provedena pomocí softwaru FlowJo v. 10 (stromová hvězda). Obrazovka markeru buněčného povrchu byla provedena jednou pro 3D optické vezikuly a jednou pro hPSC-RPE den 60.

buněčná kultura

hESC linie HS980 a HS983 byly dříve odvozeny a kultivovány za podmínek bez xeno-free30 (švédský Úřad pro etický přezkum: 2011/745: 31/3). Dárci dali informovaný souhlas s odvozením a následným použitím linií hESC. Linka WA09/H9 hESC byla získána z Wicell a byla upravena pro kultivaci bez krmiv na hrLN-521 (10 µg / mL, Biolamina). Buňky byly udržovány klonální šíření na hrLN-521-potažené desky v NutriStem hPSC XF střední (Biologické Odvětví), v 5% CO2/5% O2 inkubátoru, a pasážovány enzymaticky v 1:10 poměr každých 5-6 dní.

hiPSC řádky, CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-i a CTRL-14-II byly laskavě poskytl Karolinska Institutet iPSC Core facility (švédské Etický Přezkum Orgán: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Dárci dali informovaný souhlas s odvozením a následným použitím linií hiPSC. Buňky byly udržovány klonální šíření na hrLN-521-potažené desky (Biolamina) v NutriStem hPSC XF střední (Biologické Odvětví), v 5% CO2/5% O2 inkubátoru a pasážovány enzymaticky v 1:10 poměr každých 5-6 dní.

Pro passaging, splývající kultury byly promyty dvakrát s fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) bez Ca2+ a Mg2+ a inkubovány po dobu 5 min při 37 °C, 5% CO2/5% O2 s TrypLE Vyberte. Enzym byl poté opatrně odstraněn a buňky byly shromážděny v čerstvé předehřáté NutriStem hPSC XF středně jemným pipetování k získání jednobuněčné suspenze. Buňky byly centrifugovány při 300 × g po dobu 4 min, pelety resuspendovány v čerstvém pre-zahřeje NutriStem hPSC XF médium a buňky naneseny na čerstvě hrLN-521-potažené misky. Dva dny po průchodu bylo médium nahrazeno čerstvým předehřátým NutriStem HPSC XF médiem a denně měněno.

HPSC-RPE jednovrstvá diferenciace

postupný protokol popisující diferenciační protokol lze nalézt na protokolu Exchange36. hESC nebo hiPSC byly naneseny při hustotě buněk 2,4 × 104 buněk / cm2 na misky potažené lamininem (20 µg / mL)za použití NutriStem hPSC XF média. Rho-kinázy (Y-27632, Millipore) v koncentraci 10 µM byl přidán během prvních 24 h, zatímco buňky byly uchovávány při 37 °C, 5% CO2/5% O2. Po 24 h, hPSC médiu byl nahrazen diferenciace střední NutriStem hPSC XF bez základní fibroblastový růstový faktor (bFGF) a transformující růstový faktor-β (TGFß) (Biologických průmyslových Odvětví) a buňky byly umístěny na 37 °C, 5% CO2/21%O2. Od 6. dne po pokovování bylo do média přidáno 100 ng/mL aktivinu A (R&D systémy). Buňky byly krmeny třikrát týdně a uchovávány po dobu 30 dnů. Monovrstvy byly poté trypsinizovány pomocí TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) po dobu 10 minut při 37 °C, 5% CO2. Enzym byl pečlivě odstraněn a buňky byly shromážděny v čerstvé předehřáté NutriStem hPSC XF střední bez bFGF a TGFß jemným pipetování k získání jednobuněčné suspenze. Buňky byly centrifugovány při 300 × g po dobu 4 min, pelety byly resuspendovány, prošel přes buněčné sítko (ø 40 µm, BD Biosciences), a buňky byly nasazeny na lamininu-potažené nádobí (hrLN-111 a hrLN-521 v 20 mg/mL) v různých buněčných hustot v rozmezí od 1,4 × 106 1,4 × 104 buněk/cm2. Replakované buňky byly krmeny třikrát týdně během následujících 30 dnů NutriStem hPSC XF médiem bez bFGF a TGFß. Pro diferenciaci hPSC-RPE in vitro ve 3D suspenzi EBs jsme postupovali podle našeho dříve publikovaného protokolu10. Krátce, pluripotentní kmenové buňky byly kultivovány na soutoku na rhLN-521 a ručně poškrábaný vyrábět EBs pomocí 1000 µL pipety. EBs byly poté kultivovány v suspenzi v nízkých upevňovacích deskách (Corning) při hustotě 5-7 × 104 buněk/cm2. Diferenciace byla provedena v médiu NutriStem hESC XF na zakázku, ve kterém byly bFGF a TGFß eliminovány změnou média dvakrát týdně. Deset mikromolu Rho-kinázy (Y-27632, Millipore) byl přidán k suspenzi kultury pouze během prvních 24 h. Následujících 5 týdnů diferenciace, pigmentové plochy byly mechanicky vystřižené z EBs pomocí skalpelu. Buňky byly poté disociovány pomocí TrypLE Select, následované proplachováním 20 G jehlou a stříkačkou. Buňky byly naočkovány buněčným sítkem (ø 40 µm, Bd Biosciences) na miskách potažených LN při hustotě buněk 0.6-1, 2 × 104 buněk / cm2 a krmena dvakrát týdně stejným diferenciačním médiem uvedeným výše. Snímky jasného pole byly pořízeny mikroskopem Nikon Eclipse TE2000-S a kamera Canon SX170 IS byla použita k zachycení pigmentace z horní části jamek.

Kvantitativní PCR v reálném čase

Celková RNA byla izolována pomocí RNeasy Plus Mini Kit a zacházet s RNase-free Dnázy (oba z Qiagen). Komplementární DNA (cDNA) byla syntetizována pomocí 1 µg celkové RNA ve 20 µL reakční směsi, obsahující random hexamer a Superscript III reverzní transkriptázy (Gibco, Invitrogen) podle návodu výrobce.

průtoková cytometrie

třídění buněk bylo provedeno na kulturách hPSC-RPE po 21 nebo 30 dnech diferenciace. Buňky byly inkubovány se zmíněnými konjugovanými protilátkami na ledu po dobu 30 minut. Pro každou podmínku byly zahrnuty kontroly FMO k identifikaci a gate-negativních a pozitivních buněk. Obarvené buňky byly poté tříděny pomocí třídiče fúzních buněk BD FACS Aria (Bd Biosciences) pomocí sofware FACSDiva V8.0.1.

ihned po třídění bylo 70 000 buněk zředěných ve 100 µL 2% FBS a 1 mM EDTA (Sigma) cytospinováno po dobu 5 minut při 400 r.p.m. na skleněné sklíčka. Sklíčka byla ponechána přes noc sušit při pokojové teplotě, následovala fixace 4% formaldehydem bez methanolu při pokojové teplotě po dobu 10 minut a imunofluorescenční barvení.

imunofluorescence

histologie a tkáňové imunostaining

bezprostředně po eutanazii intravenózní injekcí 100 mg/kg pentobarbitalu (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), oči byly enukleovaného a puchýřek injekční oblasti označeny zelenými Tkáně Označení Barvivo (TMD) (Histolab Produkty). Intravitreální injekce fixačního roztoku 100 µL (FS) sestávajícího ze 4% pufrovaného formaldehydu (Solvenco AB) byla provedena před fixací v FS po dobu 24-48 h a vložením do parafínu. Čtyři mikrometrické sériové sekce byly vyrobeny prostřednictvím oblasti označené TMD a každé čtyři sekce byly obarveny hematoxylinem–eosinem.

pro imunostaining byly diapozitivy deparafinizovány v xylenu, dehydratovány v tříděných alkoholech a opláchnuty ddH2O a Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem (TBS, pH 7,6). Antigen retrieval bylo dosaženo v 10 mM citrátovém pufru (trinatrium-citrát dihydrát, Sigma-Aldrich, pH 6.0), s 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) na 96 °C po dobu 30 minut, následuje 30 min při pokojové teplotě. Sklíčka se promyjí s TBS a blokovány po dobu 30 min s 10% normální oslí sérum (Abcam) zředěného v TBS obsahující 5% (w/v) IgG a proteázy-zdarma bovinní sérový albumin (Jackson Immunoresearch) ve zvlhčené komory. Primární protilátky ředěné v blokačním pufru byly inkubovány přes noc při 4 °C: lidské jaderný protein mitotického aparátu (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), NEJLEPŠÍ-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-432), a CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-7326, klon ) (Doplňující Údaje 2). Sekundární protilátky (donkey anti-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 a donkey anti-mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, a to jak z Thermo Fisher Scientific) (Doplňující Údaje 2) ředěné 1:200 v blokujícím pufru byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě. Oddíly byly namontovány s vektorovou Vectashield s DAPI ((4′,6-diamidino-2-phenylindole)) montážní medium (Vector Laboratories) v rámci 24 × 50 mm2 krycí sklíčko.

Pro imunohistochemii, skluzavky byly deparaffinized následuje antigen retrieval (ER2 solution, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) a barvení (IHC Protokolu. F) pro CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-432) a CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-7326, klon ) protilátky (Doplňující Údaje 2) na Pouto RXm nástroje (Leica Biosystems).

snímky byly pořízeny fluorescenčním invertovaným mikroskopem Olympus IX81 nebo konfokálním mikroskopem Zeiss LSM710-NLO point scanning. Post-akviziční analýza snímků byla provedena pomocí softwaru ImageJ.

Fagocytóza test

Fluorescein isothiokyanátem-označené skotu, Příp byly izolovány a laskavě poskytnuta Dr. E. F. Nandrot z Institut de la Vision, Paris37. buňky hPSC-RPE byly kultivovány na transwell membráně (0,33 cm2, Corning) potažené hrLN-521 20 µg / mL po dobu 1 měsíce po setí. Buňky byly inkubovány při 37 °C nebo 4 °C po dobu 16 h s 2,42 × 106 rozmražené POS/Transwell ředěný v DMEM (Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium) nebo CO2-nezávislých sdělovacích prostředků (jak z Thermo Fisher Scientific), resp. Po inkubaci byly buňky uhaseny roztokem Trypan Blue 0.2% (Gibco, Invitrogen) po dobu 10 min při pokojové teplotě, fixovány 4% methanol-volného formaldehydu (Polysciences) při pokojové teplotě po dobu 10 min, a permeabilized s 0,3% Triton X-100 v PBS po dobu 15 min. Rhodamine phalloidin barvení (1:1000, 20 min při pokojové teplotě, Biotinum 00027) (Doplňující Údaje 2) byl použit k vizualizaci buněčných hranic. Jádra byla obarvena Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min při pokojové teplotě, Invitrogen).

snímky byly získány konfokálním mikroskopem Zeiss LSM710-NLO point scanning. Post-akviziční analýza snímků byla provedena pomocí Imaris (Bitplane) a POS čísla skončili s CellProfiler 2.1.1 software. Použité moduly: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages a ExportToSpreadsheet. Objekty byly identifikovány typické průměru 10-40 pixel jednotek pomocí Dvou Tříd, Globální, Otsu, Vážený rozptyl prahování metody s 0,01 a 1,0 dolní a horní meze, a 2,1 korekční faktor, s denzním objekty vyznačují intenzitou.

Enzyme-linked immunosorbent assay

hPSC-RPE buňky byly kultivovány na Transwell membrány (0.33 cm2, Millipore), potažené různými substráty. Supernatanty z apikální a bazální strany hPSC-RPE (což znamená horní a dolní kompartment transwell) byly odebrány 60 h po změně média. PEDF sekrece hladiny byly měřeny v kopie pro každý stav s komerčně dostupné lidské PEDF ELISA Kity (BioVendor RD191114200R) byly použity v souladu s pokyny výrobce, po 60 dnech z kultury. Sreadings optické hustoty byly měřeny pomocí čtečky Microplate Spectramax 250 (molekulární zařízení). Výsledky jsou prezentovány jako průměr ± SEM.

TIRO měření

Transepithelial elektrický odpor RPE buněk á na Transwells (0.33 cm2, Millipore) byly měřeny pomocí Millicell Elektrický Odpor Systému volt-ohm metr (Millicell ERS-2, Millipore), podle pokynů výrobce. Šedesátidenní kultury byly před experimentem vyrovnány mimo inkubátor při pokojové teplotě po dobu 15-20 minut. Měření byla provedena v nezměněném kultivačním médiu ve trojím vyhotovení pro každý stav, ve třech různých polohách každé jamky. Pro další analýzu byly použity průměry. Odpor pozadí byl stanoven z prázdné kultivační vložky ve stejném médiu potaženém odpovídajícím substrátem, ale bez buněk, a odečten od příslušné podmínky experimentu. Měření jsou uváděna jako odpor v ohmech krát plocha v centimetrech čtverečních (Ω × cm2). Výsledky jsou prezentovány jako průměr ± SEM.

Skenování elektronové mikroskopie

hPSC-RPE buňky byly pěstovány na transwell vložky potažené LN521 (20 µg/mL) po dobu 60 dní. Byly fixovány ponořením do 2,5% glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru, pH 7,4. Transwellova membrána byla vyříznuta a promyta v Miliq vodě před postupnou dehydratací ethanolu a sušením v kritických bodech za použití oxidu uhličitého (Leica EM CPD 030). Vložky byly namontovány na pahýly vzorků pomocí uhlíkových lepicích jazýčků a naprašování potaženého tenkou vrstvou platiny (Quorum Q150T ES). Snímky skenovací elektronové mikroskopie byly získány pomocí skenovacího elektronového mikroskopu s emisemi pole Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Německo) při 3 kV a detektoru SE2.

Transmisní elektronové mikroskopie

hPSC-RPE buňky byly pěstovány na transwell vložky potažené LN521 (20 µg/mL) po dobu 60 dní. Byly fixovány ponořením do 2,5% glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru, pH 7,4. Na transwell membrány byl řez ven a na tenké proužky, opláchnuty 0,1 M fosfátový pufr, následuje po fixaci v 2% oxidem osmičelým v 0,1 M fosfátový pufr, pH 7.4, při 4 °C po dobu 2 h. Membránové proužky byly podrobeny postupné dehydrataci ethanolem a nakonec ploché vložené do LX-112. Ultratenkých řezů (~50-60 nm) byly připraveny pomocí Leica EM UC7 a kontrastoval s uranyl acetát, následuje vést citrát. Transmisní elektronová mikroskopie zobrazovací byla provedena na Hitachi HT7700 transmisní elektronový mikroskop (Hitachi High-Technologies), který je provozován při 80 kV a digitální snímky byly pořízeny pomocí CCD kamery Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions).

Single-cell RNA sekvenování bioinformatická analýza

Šedesát den hPSC-RPE buňky byly odděleny pomocí TrypLE Vyberte a prošel přes buněčné sítko (ø 40 µm, BD Biosciences). Byly resuspendovány v koncentraci 1000 buněk / µL v 0,04% BSA v PBS. Buňky byly transportovány při teplotě 4 °C do Eukaryotické jednotlivých Buněk Genomika Zařízení (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Švédsko), kde 3′ cDNA knihovny byl připraven pro single-cell RNA sekvenování s 10x Genomika platformy (10x Genomika) pomocí NovaSeq 6000 software. Cell Ranger 2.1.1 (10x genomika) potrubí byl použit pro konverzi Illumina základní volání souborů do formátu fastq, zarovnat sekvenování čte na hg19 transkriptomu pomocí STAR aligner38, a generovat funkce čárového kódu matice. Mobilní Ranger kontroly kvality filtrované buňky (718, 810, 931, a 1129 buněk obsahující kapičky byly zachyceny pro CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replated 1:20 a embryonálních kmenových buněk, vzorků, v tomto pořadí) byly analyzovány v R verzi 3.5.1 (R Core Team)39, pomocí Seurat suite verze 2.3.440,41. Jako další kontroly kvality opatření, RPE buněk se jednoznačně vyjádřil geny (≥2000 k ≤5000), UMIs (≥10 000 až ≤30,000) a procento UMI mapování MT genů (≥0.025 ≤0.10) byly vybrány. Podobně, embryonálních kmenových buněk, s jednoznačně vyjádřenou geny (≥2000 k ≤8000), UMIs (≥10 000 až ≤80,000), a procento UMI mapování MT genů (≥0.025 ≤0.10). Výsledkem tohoto kroku filtrace byl konečný datový soubor 616, 725, 779 a 905 buněk pro vzorky CD140b+GD2 -, CD140b+CD184 -, replated 1:20 a hESC. Před redukci dimenzionality pomocí hlavních komponent (PC), analýzy, mobilní–mobilní rozdíly v genové expresi vedený UMIs, mitochondriální genové exprese a buněčného cyklu fáze byly ustoupila během dat škálování process42. Variabilní geny v RPE vzorky byly vybrány na základě jejich normalizované průměrné projevu a rozptyl (výraz cut-off = 0.0125–5, a spodní rozptyl cut-off = 0.5). Pro výběr PC byly vyhodnoceny nálezy PCHeatmap, jackStraw, pc standardní odchylky a Clustree analýzy43. Prvních 15 počítačů bylo použito pro projekt tsne44 a shlukovací analýzu(rozlišení = 0,1, zmatenost = 40).

buněčné shluky byly analyzovány dvěma přístupy. Horní diferenciální geny byly poprvé identifikovány pro každý klastr pomocí Wilcoxonova testu rank-sum. Sekundární, podpisová genová exprese (skóre modulů) byla vypočtena pro nediferencovaný hESC a několik typů buněk přítomných v lidské sítnici. Buněk exprimujících mesoderm markery byly ručně rozděleny do samostatného clusteru pomocí interaktivní vykreslování funkce Seurat. Data jsou nahrána v ArrayExpress (EMBL-EBI) – viz podrobnosti níže.

Zvířata

Po schválení ze Severní Stockholmu pokusů na Zvířatech Etické komise (DNR N25/14), 10 Nový Zéland bílý albín králíků (za předpokladu, Lidköpings králičí farmy, Lidköping, Švédsko) ve věku 5 měsíců, o hmotnosti 3,5 až 4,0 kg byly použity v této studii. Všechny experimenty byly provedeny v souladu s prohlášením o použití zvířat v očním a zrakovém výzkumu.

Ny transplantaci

hPSC-RPE monovrstvy byly promyty PBS, inkubovány s TrypLE, a disociované na jednobuněčné suspenze. Buňky byly počítány v Neubauer hemocytometer komory pomocí 0,4% Trypanovou modří (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugována při 300 × g po dobu 4 min, a buněčné pelety byly resuspendovány v čerstvě filtr-sterilizované PBS na výslednou koncentraci 1000 buněk/µL. Buněčná suspenze byla poté asepticky alikvotována na 600 µL jednotek a udržována na ledu až do operace.

Zvířata byla uvedena do celkové anestezie intramuskulární podání 35 mg/kg ketaminu (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) a 5 mg/kg xylazinu (Rompun veterináře. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), a rozšířené zorničky s mix 0,75% cyklopentolát/o 2,5% fenylefrinu (APL). Mikrochirurgie byly provedeny na obou očích pomocí 2-portové 25 g transvitreální pars plana technika (Alcon Accurus, Alcon Nordic), jak bylo popsáno dříve45. Buněčná suspenze byla natažena do 1 mL stříkačky připojené k prodlužovací trubici a 38G polytipové kanyly (MedOne Surgical Inc). Bez předchozí vitrektomie byla kanyla vložena přes horní temporální trokar. Po řádném tip polohování, zjistil kontaktní sítnice světlice, 50 µL buněčné suspenze (odpovídá 50 000 buněk) byl injekčně pomalu subretinally ~6 mm pod dolní okraj zrakového nervu, které tvoří jednotný puchýřek, který byl jasně viditelný pod operačním mikroskopem. Během injekce byla věnována pozornost udržení špičky v blebu, aby se minimalizoval reflux. Po odstranění nástroje byl na sklerotomie bez utěsnění švů aplikován lehký tlak. Dva mikrogramů (100 µL) do sklivce triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) byl podáván 1 týden před zákrokem, a ne post-chirurgické antibiotika byla podávána.

Statistiky a reprodukovatelnost

Pro statistické analýzy, dva-cesta analýza rozptylu a post hoc vícenásobné porovnávání pomocí Tukey test korekce byly provedeny pro posouzení in vitro rozdíly různých hustot posouzen a třídění versus replated podmínky v TEER a PEDF sekrece testy.

všechny kvantifikace byly provedeny bez zaslepení. Statistické parametry včetně definic a přesné hodnoty n (např. celkový počet experimentů, replikace atd.).), odchylky, hodnoty P a typy statistických testů jsou uvedeny na obrázcích, odpovídajících číselných legendách a v této části. Statistická analýza byla provedena pomocí Prism 7 (Software GraphPad, verze 7.0 c). Ve všech případech byla statistická analýza provedena na datech nejméně tří biologicky nezávislých experimentálních replik. Srovnání mezi skupinami bylo plánováno před statistickým testováním a velikost cílového účinku nebyla předem stanovena. Chybové sloupce zobrazené na grafech představují průměr ± SEM nejméně tří nezávislých experimentů. Všechny zobrazené mikrografy jsou reprezentativními obrazy tří nezávislých experimentů, pokud není uvedeno jinak (např. 1c).

souhrn hlášení

Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.