Využití ATP analogických inženýrství CDKs

Jsme vytvořili mutantní ‚Shokat‘ CDKs obsahující aminokyseliny výměny v konzervované objemné zbytky v jejich ATP vazebné kapsy. V případě CDK2 a CDK3 to byl fenylalanin, alanin výměnu na pozici 80, určené CDK2 (F80A). Jsme také syntetizován 12 ATP analogy určit, zda inženýrství CDKs můžete použít tyto analogy fosforylovat rekombinantní Retinoblastom (Rb) bílkoviny in vitro, a zjistil, že jsou využívány N6-(2-phenylethyl)-ATP (PE-ATP) nejvíce efektivně (Obrázek 1a, a údajů, které nejsou uvedeny). I když obě wild-type a cyklin E-CDK2 (F80A) používá normální ATP fosforylovat glutathion-S-transferázy (GST)-Rb proteinu, pouze F80A kinázy mohl použít PE-ATP. Podobné výsledky byly získány s cyklin E-CDK3, ale v tomto případě F80A mutant již nemohla používat normální ATP, ačkoli strukturální základ pro toto pozorování je nejasný (viz Obrázek 1a). Tyto studie potvrdily, že kinázy divokého typu a upravené kinázy vykazují požadované ATP specifika.

Vzhledem k tomu, že mutant CDKs efektivně použít PE-ATP fosforylují Rb in vitro, podobné experimenty s využitím značeného PE-ATP v buněčné lyzáty se nezdařilo, protože značeného fosfátu byl odštěpen z PE-ATP pomocí Atpasy, aktivita v lyzáty (údaje nejsou uvedeny). Proto jsme přešli na thiofosfátovou formu analogu ATP (PE-ATP-γ-S), který nebyl hydrolyzován lyzáty (obrázek 1b). Ačkoli kinázy často používají ATP-γ-S méně účinně než normální ATP, thiofosforylace má v této souvislosti několik výhod. Za prvé, thiofosfáty jsou stabilnější a odolnější vůči fosfatázám . Za druhé, protože v buňkách neexistují žádné preexistující thiofosforylační události, značení thiofosfátů poskytuje jedinečné markery pro proteiny fosforylované mutantní kinázou. Konečně, thiophosphate skupina má podobné chemické vlastnosti jako sulfhydrylové skupiny a je přístupný chemické úpravy. Vyjádřili jsme a čištěná rozpustná wild-type a cyklin A-CDK2 (F80A) komplexy z bakterií a provádí podobné Rb kinázy testu k testování jejich schopnost používat PE-ATP, γ-S. Jak je znázorněno na Obrázku 1c, i když obě kinázy mohou využívat ATP nebo ATP-γ-S fosforylovat GST-Rb proteinu (jak je naznačeno jeho elektromobility směna) pouze F80A mutant můžete použít PE-ATP, γ-S. Máme tedy použit PE-ATP, γ-S pro všechny naše další studium.

Single-step čištění thiophosphorylated peptidů

použití umělých CDKs a ATP analogy usnadňuje vysoce specifické fosforylace substrátu: další výzvou je, jak je identifikovat v rámci komplexní lyzátu. Snažili jsme se využít thiophosphate značky kovalentně zachytit a obohatit thiophosphorylated peptidy po fosforylace a trávení lyzáty. Klíčovým problémem však bylo chemicky rozlišit thiofoshopeptidy a peptidy obsahující cystein. Ačkoli byla popsána chemoselektivní metoda obohacování thiofoshopeptidů, ohromné množství cysteinových zbytků v komplexní proteinové směsi ztěžuje tento přístup . Použili jsme jednoduchou metodu zachycování a uvolňování k selektivní izolaci thiofosforylovaných peptidů v trypsinizovaných buněčných lyzátech (obrázek 2a). Proteinů v lyzátu byly fosforylován in vitro s cyklin A-CDK2 (F80A) a PE-ATP, γ-S. protein směs byla následně štěpeny a vzniklé peptidy byly smíchány s Thiopropyl Sepharose 6B , aktivní disulfid pryskyřice, která zachycuje oba cystein obsahující peptidy a thiophosphopeptides přes disulfidové výměně reakce. Protože tradiční dithiothreitolu (DTT) eluční zprávy oba druhy vázané peptidy, využili jsme kvalitativní rozdíly mezi pryskyřice vázané thiophosphate peptidy a cystein obsahující peptidy v phosphorothiolatesulfide propojení a alkyldisulfide vazba, resp. Při vysokých hodnotách pH se hydrolyzuje fosforothiolátsulfidová vazba a alkyldisulfid zůstává neporušený . Léčba pryskyřicí s silnou základnu (např. hydroxid sodný), konkrétně verzí thiophosphopeptides (a také převádí je do normální phosphopeptides), ale ne cystein obsahující peptidy hydrolýzou na phosphorothiolatesulfide vazby (Obrázek 2b). Protože peptidy vázané cysteinem nejsou v posledním kroku eluovány, nemůžeme obnovit thiofoshopeptidy obsahující cystein. Eluce navíc vede ke ztrátě thiofosfátového podpisu přeměnou thiofoshopeptidu na fosfopeptid. Naše metoda izolace thiofoshopeptidů se mírně liší od metody Blethrow et al. v tom, že jsme zachytit thiophosphopeptides pomocí disulfidové výměně chemie (disulfid pryskyřice) místo alkylace (iodoacetamide pryskyřice), a my selektivně eluovat je s base hydrolýzy spíše než oxidace.

testovat proveditelnost tohoto přístupu, jsme fosforylované GST-Rb s cyklin A-CDK2 (F80A) a PE-ATP, γ-S, a aplikuje náš postup čištění na trypsin trávení reakční směsi. Izolované peptidy byly analyzovány elektrosprejovou tandemovou hmotnostní spektrometrií (ESI-MS/MS) pomocí hmotnostního spektrometru iontové pasti. Peptidy byly identifikovány porovnáním tandemových hmotnostních spekter s databází lidských proteinových sekvencí (s přidanou sekvencí GST-Rb) pomocí softwaru SEQUEST . Substrát GST-Rb obsahuje pět cysteinů a sedm míst SP / TP, což jsou místa upřednostňovaná pro fosforylaci CDK . Získali jsme více fosfopeptidů obsahujících pouze a všechna očekávaná fosforylační místa (Tabulka 1). Kromě toho jsme neobnovili žádné peptidy obsahující cystein a jen velmi málo nespecifických peptidů. To poskytlo důkaz principu pro naše rozsáhlé testy.

Identifikace lidských cyklin A-CDK2 substráty v buněčné lyzáty

Naším cílem bylo identifikovat potenciální cyklin A-CDK2 substráty na proteomu-široký rozsah. Pro snížení složitosti vzorku jsme frakcionovali celý buněčný lyzát buněk HEK293 na 11 frakcí pomocí iontoměničové chromatografie a srážení síranu amonného (další datový soubor 1). Poté jsme provedli in vitro kinázové testy na každé frakci. Jako pozitivní kontrolu jsme do každé reakce přidali také malé množství GST-Rb. Po strávení reakční směsi s trypsinem jsme použili náš purifikační protokol k izolaci thiofoshopeptidů z peptidových směsí. Získané peptidy byly podrobeny kapalinové chromatografii-MS / MS analýze a vyhledávání v databázi. Našli jsme různé počty peptidů a alespoň jeden Rb fosfopeptidů z každé frakce lyzátu (Další datový soubor 2).

CDKs fosforylují proteiny na prolin-directed způsobem, a to buď na serin nebo threonin, a četné studie podporují myšlenku, že motiv S/T-P-X-R/K představuje CDK konsensu motivem. Z fosfopeptidů jsme identifikovali celkem 203 proteinů: 180 kandidátů bylo fosforylováno v motivech SP nebo TP (prolin-directed; další datový soubor 3). Tyto kandidátské substráty představují širokou škálu biologických procesů, včetně kontroly buněčného cyklu, metabolismu DNA a RNA, translace a buněčných struktur (obrázek 3). Celkem 96 z 222 (43%), prolin-directed stránky připodobněni známo, CDK konsensu (s kladně nabitá rezidua v +3 pozice). Je zajímavé, že o 24% prolin-directed stránky (53/222) obsahuje kladně nabité zbytky buď na +4 nebo +5 pozic, což naznačuje, že tento motiv může být také zvýhodněný CDK2. Vskutku, Blethrow a kol. také poznamenal, že značný počet substrátů cyklinu B-CDK1 obsahuje místa bez konsensu. Pro peptidy, které obsahovaly non-shoda stránek, jsme zjistili, že asi 50% odpovídajících proteinů provedena alespoň jedna K/RXLφ nebo K/RXLXφ motiv (kde φ je velký hydrofobních reziduí, a X je jakákoli aminokyselina) distální k fosforylaci míst, a téměř všichni z nich provedena alespoň jeden minimální RXL motiv (Další datový soubor 3). To je v souladu se zavedenou myšlenkou, že tyto motivy podporují vazbu cyklinu a-CDK2 na substráty . Kromě výběru pro fosforylace s CDK konsenzus motivy, jsme identifikovali 28 proteinů, které byly dříve zapojeny jako CDK substráty (označené tučně v Doplňkových údajů soubor 3) . Téměř 15% našich kandidátů bylo dříve nalezeno jako cíle CDK, což dále podporuje myšlenku, že naše metody byly zachyceny a obohaceny o substráty CDK2. Konečně, 43% fosforylace našli jsme byly předtím označeny ve velkém měřítku, in vivo phosphoproteome analýzy, což naznačuje, že tyto fosforylace nejsou omezeny na naše v lyzátu podmínky .

jak naše studie, tak studie hlášené Blethrowem et al. používá podobné izolaci fosfopeptidů systémy a související cyklin-CDKs, a očekávali jsme, že tam může být značný přesah v substrátech odhalila obou studiích. Opravdu, jsme našli téměř 50% (30/68) cyklin B-CDK1 substráty v našem seznamu cyklin A-CDK2 kandidátů; tedy, tyto metody jsou robustní a reprodukovatelné (Další datový soubor 4). Nicméně, tam jsou také značné rozdíly mezi dvěma seznamy, a tyto pravděpodobně výsledkem mnoha faktorů, včetně procesní rozdíly, různé typy buněk, neúplné peptidů identifikace pomocí MS, a substrátová specificita svěřené cyklin a/nebo podjednotky kinázy. Některé z těchto rozdílů mohou také odrážet různé biologické funkce cyklinu a-CDK2 a cyklinu B-CDK1. Například jsme zjistili, devět proteiny podílející se na bílkoviny překlad a/nebo funkce ribozomu, ale žádný z těchto proteinů byly nalezeny s cyklin B-CDK1, i přes jejich relativně vysoké množství.

přestože jsme identifikovali řadu známých substrátů CDK2, neidentifikovali jsme některé dříve popsané substráty CDK2. Některé z výše uvedených faktorů mohou také odpovídat za to, že v našich analýzách nebyly nalezeny známé substráty CDK2. Kromě toho by substráty již fosforylované endogenními CDK nebyly in vitro thiofosforylovány. Je také možné, že některé proteiny byly rozpuštěny v lyzátu příprava a/nebo ultrazvuku krok a vyloučeny z našich analýz. A konečně, je možné, že velké proteinové komplexy může být narušena frakcionační postupy před kinázy reakce, a to proteiny, které jsou fosforylovány CDK2 pouze v souvislosti s těmito komplexy, nemusí být objeveny naše metody.

také Jsme zpět čtyři phosphopeptides odpovídající cyklin a, CDK2 a 27 dalších phosphopeptides s non-prolin režie lokalit (Další datový soubor 5). Měli jsme podezření, že tyto fosfopeptidy jsou výsledkem auto-fosforylace cyklinu a-CDK2 a fosforylace pozadí jinými kinázami, a jiní hlásili podobnou fosforylaci pozadí . K testování těchto možností jsme provedli kontrolní kinázy reakce pomocí cyklin A-CDK2 (F80A) a PE-ATP, γ-S bez buněčného lyzátu přidáno a zpět tři ze čtyř cyklin A-CDK2 peptidy (Další datový soubor 5). Navíc, když jsme prováděli podobný ‚kinázy-jen reakce v přítomnosti γ-32P-ATP, jsme pozorovali 32P začlenění do obou těchto proteinů v závislosti na dávce (Další data file 6). Tyto experimenty potvrdily, že v původních testech došlo k autofosforylaci cyklinu a-CDK2 na pozadí.

také Jsme provedli kontrolní kinázy reakce za použití lyzátu frakce, GST-Rb ‚spike‘, a PE-ATP, γ-S bez toho cyklin A-CDK2. Tyto ne-kinázy kontrolu reakce fosforylován 7 27 non-prolin režie phosphopeptides na našem seznamu (Další datový soubor 5), což naznačuje, že většina, pokud ne všechny, z těchto phosphopeptides výsledkem pozadí fosforylací pomocí kinázy, které jsou schopny využívat ATP analog v omezené míře. Například většina těchto peptidů obsahuje kyselá fosforylační místa zaměřená na zbytky, která jsou motivy kasein kinázy 2. Kasein kináza 2 je jedinečná v tom, že může využívat GTP i ATP; Aktivní místo tedy může pojmout objemné analogy ATP, jako je PE-ATP . Důležité je, že jsme z těchto kontrolních experimentů neobnovili žádné fosfopeptidy Rb, což naznačuje, že v našich testech nebyla žádná nespecifická aktivita CDK. Také jsme získali 44 nemodifikovaných peptidů, z nichž 12 obsahovalo zbytky cysteinu. Většina těchto peptidů pochází z několika lyzátových frakcí (Doplňkový datový soubor 2). Máme podezření, že tyto vyplývala z nízké úrovně nespecifické vazby peptidů k pryskyřice navzdory přísné mytí podmínek, a v případě cystein obsahující peptidy, z malého množství hydrolýzou alkyldisulfide spojení během eluční krok. Stručně řečeno, naše metody jsou vysoce selektivní, a naše studie identifikovala překvapivě velká skupina kandidát cyklin A-CDK2 substráty, z nichž většina ještě nebyla identifikována jako CDK cíle.

Validace kandidáta substráty jako cyklin A-CDK2 cíle

Jsme použili několik strategií k ověření některých nových kandidátů v našem seznamu jako cyklin A-CDK2 substráty. Protože naše proteinové identifikace byla na základě peptidové sekvence, začali jsme tím, že potvrzuje, že cyklin A-CDK2 fosforylované tři celovečerní a nativní kandidátů, které byly immunoprecipitated přes epitop tagy z transfektovaly 293 buněk (EF2, TRF2, a RAP1). Protože tyto proteiny nebyly přítomny na seznamu cyklin B-CDK1, zjistili jsme, zda jsou také fosforylovány cyklinem B-CDK1. Každý CDK2 kandidát byl fosforylován jak cyklin A-CDK2 a cyklin B-CDK1, i když EF2 byl fosforylován v menší míře, než buď TRF2 nebo RAP1 (Obrázek 4a). Jsme také vyjádřil TRF2, RAP1, a ribozomální protein RL12 jako GST-fúze a čistí je od Escherichia coli. Když jsme cyklin A-CDK2 se fosforylují TRF2 a RAP1 in vitro, proteiny jsou vysoce fosforylované a MS analýzy bylo zjištěno, že tyto fosforylace došlo na stejných místech jsme původně identifikován (viz Obrázek 4b). Použili jsme také cyklin A-CDK2 a cyklin B-CDK1 k fosforylovat GST-RL12, a zjistil, že obě CDKs také fosforylován RL12 in vitro (Obrázek 4c). Tyto studie tak potvrzují, že peptidy identifikované na naší obrazovce představují proteiny, které mohou být fosforylovány cyklinem a-CDK2, alespoň in vitro. I když jsme našli kvalitativní rozdíly ve schopnosti cyklin A-CDK2 a cyklin B-CDK1 k fosforylují specifické proteiny, v každém případě, kandidáti jsou fosforylovány jak CDKs. Protože enzymatický přípravek jsme použili v těchto studiích obsahovaly nadbytek volného CDK2 (F80A), jsme zvažovali možnost, že některé substrátu fosforylace může vést z asociace endogenní cyclins s CDK2 (F80A), který byl buď monomerní, nebo že může oddělit od cyklin během testu podmínky. Zjistili jsme, že množství cyklin B-CDK2 (F80A) činnost v těchto extraktů byl zanedbatelný ve srovnání s cyklin A-CDK2 (F80A), a nemohli jsme zjistit jakékoliv cyklin E-CDK2 (F80A) aktivity (Další soubor dat 7). Nicméně nemůžeme vyloučit možnost, že některé peptidy mohou být fosforylovány CDK2 (F80A) v komplexu s endogenní cyklin a specifičnost každého kandidáta substrát pro cyklin A oproti jiným cyclins, které aktivují CDK2 musí být ověřena, jak je popsáno níže.

Validace RL12 jako v vivoCDK2 podkladu

výše uvedených studií potvrzených několik nových kandidátů na naše obrazovky jako CDK2 substráty in vitro. Nicméně, k určení, zda román substrát je také fosforylován CDK2 in vivo, jsme prováděli komplexnější analýzy ribozomální protein RL12. Jsme první smíšený immunoprecipitates z epitop-tagged cyklin A-CDK2 a RL12 vyjádřené v lidských buňkách v přítomnosti γ-32P-ATP a zjistil, že cyklin A-CDK2 fosforylované RL12 in vitro (Obrázek 5a). Fosforylace byla z velké části zrušena v mutant RL12, kde zjištěných phosphoserine S38 byl nahrazen alaninem, a byla obnovena, když S38 byl nahrazen threonin (Obrázek 5b). Poté jsme použili mapování fosfopeptidů k identifikaci peptidu obsahujícího S38 a Potvrdili jsme, že byl přímo fosforylován CDK2 in vitro (obrázek 5c). Otestovat, zda RL12 je také fosforylován in vivo v CDK2 způsobem závislým na stejném místě, jsme metabolicky označené buňky s 32P-orthofosforečnan, a immunoprecipitated wild-type nebo RL12-S38A z buňky se zvýšenou expresí buď cyklin E-CDK2, katalyticky neaktivní cyklin E-CDK2, nebo CDK inhibitoru p21 (inhibovat endogenní CDKs) . Protože nemůžeme studovat endogenní RL12 fosforylace vzhledem k nedostatku vhodného anti-RL12 protilátek, tyto studie zkoumaly fosforylace mimoděložní RL12 in vivo (tyto transfekci podmínek vedlo k přibližně pěti – až deseti-krát zvýšená exprese RL12 mRNA (Další datový soubor 8). Zjistili jsme, že divoký typ RL12, ale ne RL12-S38A, byl fosforylován in vivo (obrázek 5d). Tato fosforylace byla zvýšena v buňkách se zvýšenou expresí cyklin E-CDK2, ale ne neaktivní cyklin E-CDK2, a byla snížena u buněk se zvýšenou expresí p21, CDK inhibitor (který inhibuje endogenní cyklin-CDKs; Obrázek 5d). Konečně, jsme použili fosfopeptidů mapování a phosphoamino kyseliny analýzy RL12 bílkovin immunoprecipitated z označených buněk a potvrdil, že RL12 fosforylace pomocí cyklin E-CDK2 in vivo došlo také na S38 (Obrázek 5e). Ve studiích fosfoproteomu byla také hlášena fosforylace RL12 S38 in vivo .

i když máme ověřené každý z nových kandidátů, které jsme testovali tak daleko, tím, že ukazuje, že full-délka proteiny jsou fosforylovány CDK2, někteří kandidáti na našem seznamu bude pravděpodobně dokázat, že není fyziologicky relevantní cyklin A-CDK2 substráty. Například kinázy reakce byly provedeny v lyzáty, a in vivo subcelulární kompartmentalizace mohou omezit přístup CDK2 některých kandidátů. Kromě toho je možné, že jiné buněčné kinázy jsou buď redundantní s CDK2 nebo důležitější než CDK2 s ohledem na jednotlivé substráty in vivo. Je proto důležité, aby kandidáti byli přísně hodnoceni v co nejfyziologičtějším kontextu. Za tímto účelem, v probíhajících studiích jsme pomocí gene cílení přístup k mutaci podmnožinu těchto lokalit fosforylace v endogenních genů, studium jejich fyziologický význam.