Houbového hostitele

Vláknité houby mohou sloužit jako hostitelé pro mikrobiální kyselina karmínová buněčné továrny, protože mají schopnost dodat dostatečný přísun acetyl-CoA a malonyl-CoA stavební bloky pro syntézu polyketide lešení. Nabízejí také nezbytnou buněčnou infrastrukturu pro uložení er membránově vázané C-glukosyltransferázy UGT28. Od A. nidulans má dobře vyvinuté genetické inženýrství toolbox, vybrali jsme si tento druh jako výchozí bod k rozvoji houbových kyselina karmínová buněčná továrna. Stejně jako většina vláknitých hub je a. nidulans schopen produkovat nepřeberné množství biosynteticky rozmanitých sekundárních metabolitů včetně významného počtu aromatických polyketidů. Chiang a kol. již dříve prokázáno, že delece genu klastrů, které jsou odpovědné za tvorbu hlavních endogenních PKS produkty v A. nidulans11, lepší potenciál A. nidulans jako buněčné továrny pro heterologní produkci polyketidů. Tímto způsobem se zvýší množství stavebních bloků acetyl-CoA a malonyl-COA a zjednoduší se následné chemické analýzy pro tvorbu nových produktů. Jako první krok k houbové buněčné továrny na kyselinu karmínovou produkce, proto jsme eliminovat biosyntetické dráhy pro dominující aromatických polyketidů, které by mohly potenciálně v rozporu s kyselina karmínová výroby a komplikují analýzy a následné čištění. Konkrétně genové shluky pro výrobu asperthecin, monodictyphenone, a sterigmatocystin byly odstraněny, stejně jako geny, které jsou zodpovědné za zelené konidie tvorbu pigmentu, wA a jo, byly odstraněny v non-homologní endjoining defficient A. nidulans pozadí. Kromě očekávaného nedostatku konidiálních pigmentů nevykazoval výsledný kmen NID2252 žádné viditelné účinky na morfologii a kondici (Doplňkový soubor, obr. 1). Proto jsme použili NID2252 jako referenční kmen a jako základ pro výstavbu továrny na houbové buňky pro výrobu kyseliny karmínové.

Návrh semi-přírodní cesta pro flavokermesic kyseliny anthrone formace

hlavní překážkou pro výstavbu mikrobiální kyselina karmínová mobilní továrny byl nedostatek přirozené PKS, která syntetizuje flavokermesic kyseliny anthrone, první domnělé střední dráhy. Abychom toto omezení obešli, sledovali jsme alternativní biosyntetickou cestu pro výrobu tohoto polyketidu. Na octaketide flavokermesic kyseliny anthrone, s jeho C7-C12, C5-C14 a C2-C15 cyclization vzor, by teoreticky mohl být vytvořeny v jednom kroku s tím, houbové neredukující typ jsem iterativní PKS, který má vhodný produkt šablona domény (Obr. 1 vlevo). V literatuře však dosud nebyly popsány žádné takové enzymy. Alternativní mechanismus pro formování flavokermesic kyseliny anthrone je přes dvoustupňovou reakci, kdy PKS syntetizuje non-snížená lineární octaketide řetězce, což následně je cyklizovaného do požadované struktury tím, že trans-působící cyclases/aromatases (Obr. 1 vpravo). Reakce tohoto typu existují v přírodě např. v dráze aktinorhodin (act) ve Streptomyces coelicolor12. V tomto případě, octaketide páteř je syntetizován multi-podjednotky bakteriální typ PKS II systému, KSa, KSß a AKT (zákon minimální PKS), která je snížena o actKR v pozici C9 a následně složené pomocí aromatázy/cyklázy, actARO/CYC a cyklázy actCYC2, aby výnos tricyklická sloučenina 3,8-dihydroxy-1-methylanthraquinone-2-karboxylové kyseliny (DMAC)7. DMAC zobrazuje stejný záhyb jako anthron kyseliny flavokermesové, ale je redukován v poloze C9.

zvláštního zájmu pro tuto studii je ZhuI cykláza a zhuj aromatáza ze Streptomyces sp. R1128, které katalyzují dva sekvenční cyclization reakce non-snížená lineární polyketidů do záhybů podobná flavokermesic kyseliny o throne13. Konkrétně je Cykláza ZhuI zodpovědná za uzavření prvního kruhu, C7-C12, a aromatázy ZhuJ pro uzavření druhého kruhu, C5-C14. Třetí kroužek, C2-C15, je vytvořen spontánně. ZhuI a ZhuJ byli dříve společně vyjádřeni v S. coelicolor s octaketide tvoří typ II zákona minimální PKS, což má za následek vznik flavokermesic kyseliny, známé jako 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone-2-karboxylové kyseliny (TMAC) v bakteriální literature14. Bohužel, stejné strategie může být obtížné realizovat v A. nidulans jako typ II minimální PKSs nebyly úspěšně implementovány v heterologním hostiteli mimo rod Streptomyces i přes několik attempts15. A naše pokusy o rekonstituci act miniPKS V A. nidulans a Saccharomyces cerevisiae se podobně ukázaly jako neúspěšné (údaje nejsou zobrazeny). Alternativní způsob pro vytvoření požadované non-snížená octaketide je spolehnout se na typ III PKS enzymy, které byly úspěšně vyjádřil v kvasinek, např. v souvislosti s flavonoid biosynthesis16. Zvláštního zájmu je Aloe arborescens octaketide syntázy (OKS), který byl popsán produkovat non-snížená octaketides, že se samovolně složí do SEK4 a SEK4b v vitro17 (Obr. 2a). Nicméně, v Aspergillus to zůstalo nevyzkoušené, zda produkty typu III PKSs, které jsou AKT-nezávislé enzymy, které uvolňují karboxylové kyseliny, lze sklopit ZhuI typ cyklázy, která byla popsána jednat o AKT vázané substráty. V současné studii jsme se proto vydali otestovat kompatibilitu zařízení typ III, OKS s cyclases/aromatases z bakteriální typ II PKS systémů, s cílem vytvořit umělou de novo biosyntetické dráhy pro tvorbu flavokermesic kyseliny anthrone prekurzor pro tvorbu kyselina karmínová.

Výroba polyketide prekurzory pro kyselina karmínová výroby v A. nidulans

testování in vivo výkon OKS v houbové hostitele, vložili jsme OKS řízen A. nidulans gpdA promotor jako jediné kopii do definovaného lokusu (integrace web 5, IS5) v. A. nidulans genome18. Byly vytvořeny dva kmeny, jeden vyjadřující nativní kódovací sekvenci OKS a jeden vyjadřující verzi optimalizovanou pro kodon pro expresi v A. nidulans. Po sedmi dnech inkubace na pevném růstovém médiu, viz část metody pro podrobnosti, oba kmeny vykazovaly silné červenohnědé zbarvení mycelia (obr. 2b). Metabolické profilování pomocí HPLC-HRMS kmenů neodhalily žádné stopy non-snížená octaketide, ale spíše očekává, že SEK4 a SEK4b spolu s flavokermesic kyseliny a další tři bohaté sloučeniny neznámé totožnosti (Obr. 2c), které nebyly přítomny v referenčním kmeni NID2252. SEK4 a SEK4b byly identifikovány na základě důkladné analýzy HPLC-HRMS/MS (Doplňkový soubor, obr. 2) a je v souladu s již dříve oznámil, values19 zatímco flavokermesic kyselin byl v porovnání s autentickým odkazem izolován od D. coccus9 (Doplňkový Soubor, Obr. 3). Metabolit eluuje za 13,0 min. měl pseudomolekulární ion + m / z 303.0867, odpovídající molekulární vzorec C16H14O6, v souladu se známým octaketide shunt produktu, mutactin, bylo již dříve popsáno v Streptomyces na základě experimentů s Act gene cluster7. Tato identifikace byla potvrzena podrobnou analýzou UV spektra a podpořena retenčním časem vzhledem k SEK4 a SEK4b (Doplňkový soubor, obr. 4). Dva další metabolity s molekulární vzorce C16H12O6 (m/z 299.0566) je uvedeno octaketide výrobky, ale dělal, nicméně, neodpovídá běžné shunt produktu (Doplňkový Soubor, Obr. 5). Proto, metabolity byly izolovány a struktura objasnění na základě 1D a 2D NMR experimenty označeny jako dehydro-SEK4 (také známý jako B26 bakteriální literatury) a dehydro-SEK4b20 (Doplňkový Soubor, Fíky 6-11). Vznik šesti nových polyketidů pozorován v OKS kmen může být vysvětleno tím, že tři různé spontánní první uzavření kruhu reakce: C7-C12 (SEK4, dehydro-SEK4 a flavokermesic kyselina), C10-C15 (SEK4b a dehydro-SEK4b) a C7-C12 po C9 keton snížení (mutactin) (Obr. 2a a doplňkový soubor, obr. 12). Z nich pouze první zazvonění uzavření typ (C7-C12) umožňuje následný vznik požadované flavokermesic kyseliny anthrone přes druhý C5-C14 a třetí C2-C15 uzavření kruhu. SEK4 a SEK4b již dříve byly hlášeny spontánně vysychat tvořit dehydro-SEK4 a dehydro-SEK4b, respektive, zatímco tvorba mutactin závisí na enzymatické redukci C9 pozici polyketide řetězce před folding21. Tvorba kyseliny flavokermesové, známého meziproduktu v dráze kyseliny karmínové (obr. 1), bylo neočekávané, protože nebylo hlášeno, že by se tento metabolit spontánně tvořil z neredukovaných oktaketidových řetězců. To naznačuje, že A. nidulans přirozeně produkuje řadu cykláz/aromatáz, které podporují požadovaný skládací vzor. Metabolitu profilování dva OKS vyjádření kmeny nevykazovaly žádné významné rozdíly v úrovni výroby a rozhodli jsme se zaměřit na kmen vyjádřit nativní verze OKS jako základ pro další vývoj houbové buněčné továrny na kyselinu karmínovou výroby.

Inženýrství, skládací, cesta non-snížená octaketides

promiskuitní skládací non-snížená octaketide snižuje výnos žádoucí flavokermesic kyseliny. Proto jsme si představovali, že flavokermesic kyseliny výroba by mohla být zvýšena tím, že zjednoduší proces skládání v požadovaném směru podle vyjádření kodonu optimalizované verze ZhuI a ZhuJ. Zkoumat, zda ZhuI a ZhuJ v rozporu s nativním metabolismus. A. nidulans, jsme se poprvé zkonstruovány kmeny vyjádření ZhuI a ZhuJ jednotlivě a v kombinaci z definovaných genových lokusů (IS6 a JE 7) v. A. nidulans nid2252 referenční kmen. Metabolické profilování tří kmenů HPLC-HRMS neodhalilo žádné detekovatelné metabolické rozdíly (obr. 3b). Potom jsme vyrobili kmen co-vyjádření OKS s ZhuI, který kóduje cyclases, který katalyzuje tvorbu C7-C12 první uzavření kruhu (Obr. 3a). Oproti kmen vyjadřuje pouze OKS, tento kmen ukázal 2.5-, 2.2 a 2.1-násobné zvýšení flavokermesic kyseliny, SEK4, a dehydro-SEK4 úrovně, resp. V dohodě s ZhuI vodící skládací v požadovaném směru, tyto metabolické změny byly doprovázeny snížené hladiny metabolitů obsahujících nežádoucí první kroužek záhyby (Obr. 3b a tabulka 1). Kmen co-exprimující OKS a ZhuJ, který kóduje aromatázy, které katalyzuje C5 – C14 druhý kroužek uzávěr (obr. 3a), vyvolalo 2,7 násobné zvýšení hladin kyseliny flavokermesové. Tento nárůst byl doprovázen snížením hladin metabolitů s C7-C12 první prsten složit (SEK4 a dehydro-SEK4), zatímco, jak se očekávalo úrovni metabolitů s nežádoucí C10-C15 první prsten složit (SEK4b a dehydro-SEK4b) nebyly ovlivněny (Obr. 3b a tabulka 1). Konečně, analýza napětí vyjadřující ZhuI, ZhuJ, a OKS zobrazí 4,1-násobné zvýšení v produkci flavokermesic kyseliny ve srovnání s, když OKS vyjádřil sám. Navíc je toto zvýšení o 60% vyšší než u kmenů exprimujících OK v kombinaci buď s ZhuI nebo ZhuJ (Tabulka 1). Tento výsledek naznačuje, že cykláza a aromatáza jsou aditivním způsobem schopny zvýšit tok v umělé de novo dráze směrem k požadovanému produktu, kyselině flavokermesové (obr. 3b).

Překvapivě, a velmi povzbudivé, dále metabolické analýzy kmen co-vyjádření OKS, ZhuI a ZhuJ bylo zjištěno, že zvýšená tvorba flavokermesic kyselina byla doprovázena produkcí kermesic kyseliny (Obr. 4). Proto A. nidulans poskytuje nezbytnou monooxygenázu pro přeměnu kyseliny flavokermesové na kyselinu kermesovou ,která může sloužit jako konečný meziprodukt v dráze kyseliny karmínové (obr. 1).

Výroba kyseliny karmínové v. A. nidulans

posledním krokem kyselina karmínová tvorba zahrnuje C-glukosylace z kermesic kyseliny (Obr. 5a). Odpovědný enzym pro tento krok v kyselina karmínová biosyntetické dráhy již dříve identifikován v D. kok a vyznačuje heterologní exprese v S. cerevisiae8. Proto jsme vložili UGT2 kódování genu, optimalizované pro výraz u A. nidulans, do IS4 místo NID2252 referenční napětí, a k dokončení semi-přírodní kyselina karmínová biosyntetické dráhy u A. nidulans, do stejného lokusu v napětí co-vyjádření ZhuI, ZhuJ, a OKS. Exprese samotného UGT2 v referenčním kmeni neovlivnila vzhled barvy růstového média ani metabolický profil a .nidulans ve srovnání s referenčním kmenem NID2252 (obr. 5b,c). V kontrastu, co-vyjádření OKS, ZhuI, ZhuJ, a UGT2 dal vzniknout červené zbarvení média, což naznačuje, že více ve vodě rozpustné barvivo(y) byl tvořen (Obr. 5b). Cílená LC-HRMS analýza tohoto kmene potvrdila tvorbu kyseliny karmínové22 (Doplňkový soubor, obr. 13), spolu s dcII9, 23 a izomerem dcII (Doplňkový soubor, obr. 14), ukazující, že UGT2 byl funkční V A. nidulans a mohl úspěšně dokončit biosyntetickou cestu (obr. 5c). Pozitivní identifikace kyseliny karmínové a dcII byla založena na podobných retenčních časech, UV-spektrech, MS a MS/MS fragmentačních vzorcích pro čisté standardy obou sloučenin. V literatuře byly popsány tři izomery kyseliny karmínové (kyselina karmínová, DCIV a DCVII) Stathopoulou et al.23, všechny tři vykazují různé retenční časy v analýze založené na LC-MS/ms. V naší analýze jsme pouze detekována kyselina karmínová, a ne DCIV a DCVII na základě retenčního času a fragmentace vzorku autentické kyselina karmínová, standardní izolován od D. kok (Doplňkový soubor, Obr. 13). Společně naše data pevně ukazují, že je možné produkovat kyselinu karmínovou V A. nidulans na základě polopřirozené cesty.