Přispěl Paul Barber
Extrakce DNA pomocí Chelex
Chelex je notoricky známý pro bytí jako nestálá, stejně jako je to levné a snadné. Zde je několik tipů pro dobré zesílení: 1. Někdy vzorkypracovat nejlépe, pokud je použit okamžitě, někdy je lepší počkat přes noc před použitím. Experimentujte a najděte, co funguje pro váš druh. Výsledky se mohou lišit podle taxonů.2. Při provádění počátečních PCR proveďte sériové ředění šablony.Množství extrakce Chelex DNA použité v PCR může být až polovina objemu PCR nebo až 1 mikrolitr ředění 1:10 000. Zjistil jsem, že 1 mikrolitr 1:1 je vhodný pro většinu aplikací.3. Pokud nechcete získat amplifikace z PCR poprvé s extraktem Chelex, opakujte vír, spin, inkubovat, vír, spin, sedět přes noc postup popsaný výše. Často to způsobí, že negativní PCR bude fungovat.
metoda
- pomocí bělidla sterilizujte suchou stěrku činidla a malou magnetickou míchací tyčinku.
- připraví se 5-10% hmotnostních suspenze pryskyřice Chelex100 (část Biorad 143- 3832,100-200 mesh Chelex, sodná forma) a UV sterilizovaná HPLC voda. Nejúčinnějším způsobem, jak toho dosáhnout, je vzít 50 ml sterilní Sokolí zkumavku, umístit na stupnici uvnitř malé kádinky a nulovat stupnici. Pak přidejte 5 gramů Chelexu a naplňte značku 50 ml vodou.
přesnost není kritická. Sterilní technika je.
- vložte sterilní míchadlo do zkumavky a umístěte na magnetické míchadlo. Chelex se rychle usadí, takže pokud suspenze není dobře promíchána, vaše koncentrace a výsledky budou variabilní. Udržování suspenze dobře promíchá, alikvotní 300-500micro litrů do 0,6 nebo 1,6 ml eppendorfových zkumavek (opět, sterilní) a víčko ihned. Pokud máte přístup k digestoři s laminárním průtokem, je to dobré místo k tomu. Možná budete chtít otřít měřítko a míchadlo 10% bělícím roztokem a / nebo UV sterilizovat před použitím.
- zapněte topný blok. Nastavte na 95°C. vyplňte otvory vodou.
- sterilními kleštěmi (několikrát plamenem přes alkoholový hořák ke sterilizaci) odstraňte ze vzorku malý kousek tkáně. Tento kus tkáně by měl být dostatečně velký, aby byl viditelný, ale ne tak velký, aby byl snadno viditelný. Představte si řezání části 0,2 mm standardní svorky. Tohle je dost velký. Příliš mnoho tkáně může inhibovat vaše reakce.
sterilizujte kleště mezi vzorky.
- po dokončení proveďte negativní kontrolu Chelexu ponořením sterilizovaných kleští do zkumavky suspenze Chelex.
- Vortex vzorek a chelex suspenze po dobu 10-15 sekund.
před začátkem se ujistěte, že jsou víčka pevně zacvaknuta.
- krátce odstřeďujte vzorky vysokou rychlostí v mikrocentrifuge
- Inkubujte vzorky po dobu 20 minut při 95°C
* při tomto kroku může teplota bloku mírně klesnout. Tento pokles je normální. Při inkubaci zkontrolujte zkumavky, abyste se ujistiliže víčka neodtrhla.*
- Vortex vzorky znovu po dobu 10-15 sekund.
buďte opatrní, protože pára může vyklouznout víko centrifugační zkumavky. Držte víčka dolů.
- Spřádejte zkumavky opět vysokou rychlostí v mikrocentrifuge.
- vzorky jsou připraveny k použití.
používejte supernate pouze pro PCR reakce. Chlex korálek bude inaktivovat Taq!
tato metoda je se svolením založena na původním protokolu dostupném zde.
