Abstrakt

pozadí. Exprese lidského CD133 (human prominin-1) v nádorových buňkách byla považována za marker kmenovosti a je považována za domnělý marker rakovinných kmenových buněk (CSCs). Navrhli jsme studii popisující expresi CD133 v normální kůži a v epiteliálních kožních novotvarech. Metod. Imunohistochemická exprese CD133 čtyřiceti tří ekrinních a apokrinních nádorů byla porovnána s expresí pozorovanou u jiných epiteliálních nádorů kůže. Kromě toho byla použita průtoková cytometrie k detekci exprese CD133 čtyř epiteliálních kožních novotvarů, včetně jednoho porokarcinomu. Test. Byla pozorována imunoreaktivita CD133 na apikálním nebo apikolaterálním povrchu buněk tvořících žlázové struktury. Buňky z pevných oblastí benigních nebo maligních nádorů nebyly obarveny. Kultivační buňky odvozené od porokarcinomu vykazovaly 22% pozitivních buněk CD133 pomocí průtokové cytometrie, zatímco kultury karcinomu dlaždicových buněk obsahovaly méně než 0,1%. Závěr. Tato pozorování naznačují, že CD133 je specifický marker žlázové diferenciace, který by mohl být zahrnut do diagnostického panelu kožních nádorů s možnou ekrinní nebo apokrinní diferenciací. Použití exprese CD133 jako markeru CSC by však mělo být interpretováno s opatrností v experimentech s kůží.

1. Úvod

V posledních několika letech, rostoucí tělo důkazů, byl hlášen podporuje představu, že schopnost udržet vzniku nádorů a růst výhradně zdržuje v malé populace buněk tzv. nádorových kmenových buněk (CSCs). Hledání značky, které ukazují, že kmenové buňky-jako fenotyp těchto nádor iniciující buňky, je aktivní terénní šetření, a několik kmenových buněk markery byly popsány nedávno v kožní nádory .

CD133 je lidský homolog myši prominin-1, pět transmembránové domény buněčného povrchu glykoprotein, který obdržel pozoruhodný pozornost, protože jeho výraz omezen na různých somatických kmenových buněk subpopulace . Tento povrchový antigen byl objeven jako cíl monoklonální protilátka definována jako Mab AC133, ukazatel vyjádřen subpopulace CD34 pozitivní krvetvorných kmenových buněk získaných z lidských fetálních játrech a kostní dřeni . Následně CD133 byla zjištěna v různých normálních lidských tkání včetně ledvin, prostaty, mozku a slinivky břišní, a je specificky spojena s mikroklky a jiné plazmatické membrány výstupky . Navíc, tento antigen identifikován také v hematologické malignity a v několika pevných lidských nádorů, včetně gliové nádory, karcinom prostaty, karcinom ledviny, karcinomu jater, kolorektální karcinom a maligní melanom . Cílem mnoha z těchto studií bylo určit existenci CSCs, definovat jako malou skupinu nádorových buněk, které mají schopnost sebeobnovy, nádor zahájení a růst nádoru údržbu. Protilátky běžně používané pro purifikaci buněk pozitivních na AC133 cílí na špatně charakterizované glykosylované epitopy s nejistou specificitou. Ačkoli funkční aktivita CD133 je stále kontroverzní a její fyziologická funkce ještě není stanovena, je zřejmé, že tento buněčný povrchový protein je jedinečným markerem jak plazmatických membránových výčnělků, tak membránových mikrodomén . Bylo navrženo, že v tomto buněčném umístění může CD133 působit jako regulátor membránového lipidového složení nebo se může podílet na mechanismech buněčné polarity a migrace.

V předchozí studie, že zpráva CD133 imunohistochemické barvení lidských žlázového epitelu, jako jsou slinné žlázy, slzné žlázy, slinivky břišní kabelovodů, endocervikálních žláz a potní žlázy, zvláštní vzor CD133 výraz byl popsán . V těchto epitelích bylo prokázáno, že CD133 je lokalizován na výstupky plazmatické membrány v apikálních oblastech polarizovaných buněk. Podobné CD133 apikální cytoplazmatické zbarvení buněk obklopujících lumen bylo také pozorováno u karcinomů vaječníků, tlustého střeva nebo slinivky břišní .

nalezení CD133 protilátek barvení potní žlázy buněk nás inspirovala k návrhu studie, kterou jsme nyní hlásí, za účelem vyhodnocení exprese CD133 v kůži ekrinní a apokrinní nádorů.

2. Materiály a metody

2.1. Případy

retrospektivní vyhledávání citováno 43 dříve diagnostikována kůže ekrinní a apokrinní adnexální nádory ze souborů z Oddělení Patologie Albacete fakultní Nemocnice. Byly získány skleněné sklíčka, parafínové bloky a histopatologické zprávy ze všech případů. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Případy bazocelulární karcinom () a spinocelulární karcinom () byly také zahrnuty v této studii porovnat výsledky získané v těchto novotvarů s výsledky získanými v potní žlázy nádory. Pro vyhodnocení exprese CD133 v normální kůži jsme analyzovali kůži z různých oblastí získaných z okrajů šesti chirurgicky resekovaných nádorů kůže a ze tří pitev.

Pro kulturu rakoviny kůže buněk, sedm vzorků z lidských kožních nádorů, která by odpovídala jedné endokrinní porocarcinoma a šest spinocelulární karcinomy byly získány. Čerstvá tkáň z těchto případů byla zahrnuta do dulbeccova modifikovaného Orlího média (DMEM), doplněného penicilinem/streptomycinem a fungizonem, ihned po chirurgické resekci.

2.2. Imunohistochemie

Formalin fixed, paraffin embedded tkáňové řezy 4 µm široké, deparaffinized v xylenu, a rehydrataci v odstupňované řady ethanolu. Endogenní peroxidázová aktivita byla blokována 3% H2O2 po dobu 5 minut. Diapozitivy byly ošetřeny teplem indukovaným získáváním epitopů a imunostainovány třemi různými anti-CD133 monoklonálními protilátkami: AC133 monoklonální protilátka, 293C3 monoklonální protilátka, a AC141 monoklonální protilátka (vše Miltenyi Biotec, Německo). Protilátky byly testovány v různých ředěních a časech inkubace. Detekce CD133 byla provedena pomocí systému EnVision-HRP (Dako, Glostrup, Dánsko) v platformě DakoCytomation Autostainer podle pokynů výrobce. Jako chromogen byl použit diaminobenzidin (DAB substrate system, Dako, Glostrup, Dánsko). Ze tří různých testovaných protilátek proti CD133 fungovala v parafinu pouze jedna, monoklonální protilátka AC133. Další dvě protilátky testovány nezdařilo, protože oddíly inkubovány s těmito protilátky ukázal, žádné barvení, nebo proto, že immunostaining pozorované při vysokých koncentracích protilátek byly použity byly považovány za nespecifické (podobný barvení byl pozorován u negativní kontroly). Monoklonální protilátka AC133 poskytla spolehlivé výsledky na testovaných parafinových vložených úsecích. Stanovíme pro tuto protilátku ředění 1: 10 a 40 minut inkubace při pokojové teplotě jako preferované pracovní podmínky. Následně byly všechny experimenty provedeny za těchto podmínek.

části kůže s normálními potními žlázami byly použity jako pozitivní kontroly. Kromě toho, pokud jsou přítomny v sekcích, byly jako vnitřní pozitivní kontroly použity normální potní žlázy z kůže sousedící s novotvary. Negativní kontroly byly provedeny vynecháním protilátky proti CD133 během inkubace primární protilátky.

imunohistochemické barvení pevných oblastí a acinárních nebo duktálních struktur z nádorů bylo hodnoceno Samostatně. Barvení CD133 bylo klasifikováno pomocí semikvantitativní stupnice. Acinární nebo duktální struktury byly hodnoceny následovně: ( – ) žádné barvení; (+) barvení sekreční materiálu v lumen izolované kubický nebo acinů a/nebo slabé barvení apikální nebo luminální hranici několika kubický nebo acinů; (++) přehledná barvení apikální nebo luminální hranice většiny kubický nebo acinů přítomné v nádoru; (+++) barvení apikální nebo luminální hranice všech kubický nebo acinů přítomné v nádoru. Exprese CD133 byla hodnocena dvěma staršími patology (EP a SYNC) zaslepeným způsobem bez znalosti klinických a patologických informací. V případě nesrovnalostí hodnocení, diapozitivy byly přehodnoceny oběma patology pod multihead mikroskopem, a byla získána dohoda.

2.3. Kultura Rakovinných Buněk z Kožních Nádorů

Nádor fragmenty byly mechanicky a enzymaticky členění podle trávení s kolagenázu typu IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) v hankově vyváženém solném roztoku (HBSS) při 37°C po dobu 2 hodin. Buňky byly filtrovány přes 40 µm nylonovou síť a byly dále disociovány sériovým průchodem sérologickými pipetami. Štěpená tkáň se odstředí při 1000 ×g po dobu 10 minut a peleta se několikrát promyje, aby se získala suspenze jedné buňky. Izolované buňky byly pozlacené do kultivačních baněk a pěstovány při 37°C v DMEM/F12 médiu obsahujícím 10% fetální bovinní sérum a doplněny penicilin/streptomycin a fungizone.

2.4. Analýza průtokové cytometrie

všechny pokusy byly provedeny na buněčných suspenzích připravených při prvním průchodu primární kultury z nádorů. Buňky byly odděleny za použití 0,02% EDTA ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) po dobu 15 minut při 37°C a promyty PBS před barvením. Buněčné suspenze byly upraveny na buňky / mL a inkubovány s doporučeným ředěním protilátek (1/10) po dobu 20 minut ve tmě (4°C). Jako negativní kontroly byly použity vzorky bez primární protilátky. Použitá protilátka byla anti-CD133/1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Nevázané protilátky byly odstraněny promytím PBS a buňky byly resuspendovány ve vhodném objemu pufru. Analýza byla provedena na průtokovém cytometru LSRII (BD Biosciences). Data byla analyzována pomocí summitu V5. 0. 1. 5170 software (Dako).

3. Výsledky

3.1. Klinické nálezy

kohorta pacientů sestávala z 29 mužů a 23 žen ve věku od 24 do 90 let (medián, 49 let). Místo prezentace bylo variabilní, většina z nich byla lokalizována v oblasti hlavy a krku. Klinické údaje jsou shrnuty v tabulce 1. Všichni pacienti podstoupili excizní kožní biopsii.

3.2. Imunohistochemické Nálezy

Z tři různé monoklonální protilátky testovány na formalin-fixed, paraffin – embedded tissue oddíly, a v souladu s předchozí zprávy , pouze AC133 dal citlivé a spolehlivé výsledky. Celkový imunohistochemický vzor barvení pozorovaný u této protilátky úzce souvisel s tkáňovou architekturou. Barvení bylo lokalizováno hlavně na apikálním povrchu buněk, které tvořily duktální nebo žlázové struktury. Imunohistochemické nálezy pozorované v těchto strukturách za použití anti-CD133 protilátky jsou shrnuty v tabulce 1 a jsou popsány níže. Pevné oblasti z některého z vyšetřovaných adnexálních nádorů nebo z testovaných bazálních buněk a spinocelulárních karcinomů neprokázaly pozitivitu CD133.

3.2.1. Normální Tkáň

CD133 exprese byla pozorována u endoluminální nebo apikální povrch buňky acinů a svorkou kubický normální endokrinní žlázy (Obrázek 1(a)). Mezibuněčných kanálků tvoří na laterální membrány endokrinní buňky se nachází v sekreční část normální potní žlázy byly jasně barevné (Obrázek 1(b)), stejně jako sekreci našel v lumen ekrinní potrubí. Barvení normálních apokrinních žláz v koncových kanálech bylo pozorováno na apikálním okraji buněk, i když s nerovnoměrnou distribucí. V acinárních oblastech těchto žláz, kde byla zřejmá sekrece apokrinní dekapitace, CD133 vykazovala pouze slabé nebo negativní zbarvení.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 1

CD133 v normální endokrinní žlázy skvrny endoluminální povrchu buněk a potní žlázy (). Jsou také pozorovány mezibuněčné kanálky na laterální membráně ekrinních buněk (b).

3.2.2. Nádory

CD133 nebyly exprimovány v žádném z testovaných spinocelulárních nebo bazocelulárních karcinomů. Pomocí protilátky AC133 ukázaly adnexální nádory analyzované v této práci následující vzor barvení (shrnutý v tabulce 1).

benigní nádory s ekrinní nebo apokrinní diferenciací. Všechny ekrinní spiradenoma případech prezentovány CD133 imunoreaktivitu na apikální membráně potrubí-jako struktury přítomné v nádorové uzliny. Luminální povrch epiteliálních buněk tvořících unilokulární cysty všech analyzovaných případů ekrinního hidrocystomu byl také pozitivní. Kanálky a malé cysty přítomny ve třech ze šesti ekrinní poroma případech ukázal, intenzivní barvení vnitřní vrstva buněk z množily tubulech, a to barvení byla umístěna na endoluminální hranici buňky. Další tři analyzované případy poroma vykazovaly stejný vzor barvení ve většině tubulů, ale s ( ++ ) nebo ( + ) barvicím vzorem pozitivity CD133. Struktury podobné potrubí, přítomné ve čtyřech cylindrom případech, vykazovaly také imunoreaktivitu na apikální membráně epiteliálních buněk. Barvení čtyř chondroidních syringomů bylo prominentní a všechny přítomné kanálky, které tvořily příležitostné větvící struktury, vykazovaly intenzivní pozitivitu na apikální membráně (Obrázek 2). Rozšířené a klikaté kanálky, které vedou do cystické prostory všech syringocystoadenoma papilliferum případech vykazovaly imunoreaktivitu v apikální části epiteliálních buněk nebo na luminální povrch cysty, s intenzitou, která se pohybovala od ( ++ ) ( + + + ) (Obrázek 3). Pět případů diagnostikována jako nodulární hidradenoma ukázal, izolované potrubí-jako struktury, které byly pozitivní na CD133 s apikální barvení buněk, které tvoří kanálky (Obrázek 4), které se pohybovaly v intenzitě od ( ++ ) (+++). Dva případy hidradenoma papilliferum ukázaly také expresi CD133 v apikální části žlázových struktur. Pouze dva ze šesti syringoma testovaných případů ukázaly konzistentní barvení na luminální povrch malé kanálky, které tvoří nádory, které byly lemovány obvykle do dvou vrstvách objemová epitelové buňky. Případy apokrinního hidrocystomu neprokázaly žádnou pozitivní imunoreaktivitu.

Obrázek 2

CD133 pozitivní na vnitřní povrch chondroid syringoma větvení tubulech. Není zaznamenáno žádné zbarvení stromálních buněk nebo vnějších epiteliálních buněk.

Obrázek 3

Papilární projekce syringocystadenoma papilliferum lemována pseudostratified cylindrického epitelu jsou CD133 pozitivní. Pozitivita je na endoluminálním povrchu velmi intenzivní.

Obrázek 4

Lineární CD133 barvení cylindrických buněk výstelky tubulů a hidradenoma případě. Pouze buňky, které jsou umístěny na vnitřním povrchu tubulů, jsou obarveny.

maligní nádory s ekrinní nebo apokrinní diferenciací. Na luminálním povrchu cyst u případu diagnostikovaného jako apokrinní karcinom nebyla prokázána žádná imunoreaktivita. Dva mikrocystické adnexální karcinomy analyzované v této studii vykazovaly silnou pozitivitu CD133 na apikálním povrchu buněk, které tvořily malou a velkou luminu tubulárních struktur. IMUNOSTAINING CD133 by mohl být prokázán na velmi atypických buňkách, které obklopovaly tubulární struktury případu porokarcinomu (obrázek 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Charakterizace Primárních Kulturách z Lidských Kožních Nádorů a průtoková Cytometrie Analýzy

Sedm vzorků získaných z lidských kožních nádorů byly zpracovány s cílem získání jednotné buněčné suspenze. Z důvodu nedostatečného počtu buňky získané z nádorů nebo plísňové nebo bakteriální kontaminaci, jen čtyři vzorky byly úspěšně kultivovány a analyzovány na povrchu buňky CD133/1 epitop výraz. Tyto úspěšně Kultivované biopsie zahrnují jeden ekrinní porokarcinom a tři spinocelulární karcinomy. Mikroskopické vyšetření kultivovaných buněk odhalilo různé morfologie, které se konzistentně lišily od histologického typu nádoru. Buňky dlaždicového karcinomu ukázal epiteloidní nebo vřetenité buňky vzhledu, zatímco ekrinní porocarcinoma získané buňky se více zaoblený tvar a jsou seskupeny do ostrůvků malých a atypických buněk. Přítomnost epiteliálních buněk v těchto kulturách byla potvrzena pozitivní expresí E-cadherinu a EpCam jako epiteliálních markerů.

určit, zda kožní nádor buněčné kultury obsažené populace CD133 pozitivních buněk, jsme použili průtoková cytometrie zkoumat výraz CD133/1 povrchový marker s AC133 protilátek. Všechny vzorky z spinocelulární karcinom obsahoval méně než 0,1% pozitivních buněk, zatímco téměř 22% pozitivních buněk byly zjištěny v ekrinní porocarcinoma. Obrázek 6 ukazuje reprezentativní histogramy ze dvou hodnocených typů kožních nádorů.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Spinocelulární karcinom vykazuje negativní barvení pro CD133 a 0% pozitivní CD133 buňky na průtokové cytometrii.

4. Diskuse

pokrok v biologii kožních kmenových buněk a v chápání karcinogeneze do značné míry závisí na dostupnosti markerů specifických pro charakteristické populace kmenových buněk . Známé markery kožních kmenových buněk nebo kmenových buněk, které byly identifikovány v jiných orgánech nebo nádorech, mohou být použity k detekci kožních CSC. Jedním z těchto markerů, které lze testovat v kůži, je protein CD133 (prominin-1). První hlášení údajů CD133 výraz pomocí monoklonální protilátky AC133, vyrábí proti román kmenových buněk glykoproteinový antigen, ukázal, že CD133 byla selektivně exprimovány na CD34 hematopoetických kmenových a progenitorových buněk získaných z lidských fetálních játrech a kostní dřeně, stejně jako z krve . Od té doby několik zpráv ukázalo, že prominin-1 lze použít k identifikaci a izolaci lidských kmenových buněk z různých zdrojů , včetně hematopoetického systému , prostaty , pankreatu nebo ledvin . Kromě toho, monoklonální protilátky proti CD133 byly použity pro identifikaci a izolaci domnělého populace tumor-iniciující buňky nebo CSCs u řady lidských karcinomů a v maligní melanom . U gliomu byl jako významný prognostický faktor navržen zvýšený počet CD133 pozitivních rakovinných buněk, stejně jako přítomnost shluků těchto buněk, nezávisle na jiných faktorech, jako je stupeň nádoru . Jiné studie, které používají různé a nové klony anti-CD133, však naznačují, že exprese CD133 není omezena na kmenové a progenitorové buňky a zdá se, že je exprimována v dospělých epiteliálních buňkách myší a lidských tkání . Například pomocí klonu CD133, zvaného 13A4, odvozeného z myši prominin-1, Weigmann et al. prokázána exprese prominin-1 na apikální povrchu neuroepithelial buněk a dospělých ledvinových proximálních tubulů, a Karbanová et al. pomocí monoklonálních protilátek (80B258) vytvořené proti lidské prominin-1 polypeptid, pozorované imunoreaktivitu u dospělých lidských tkání, zejména v žlázového epitelu. Tyto výsledky naznačují potřebu dalších studií k objasnění, zda je antigen AC133, dříve nalezený v průtokové cytometrii omezen na CD34 pozitivní progenitorové buňky, exprimován v dospělých epiteliálních buňkách . Bylo navrženo, že pozorovaná proměnná exprese CD133 souvisí s diferenciální afinitou různých protilátek k různým glykosylovaným formám CD133 . Monoklonální protilátky AC133 rozpozná glykosylovaného epitopu z prominin-1 , a, zajímavé je, že glykosylace tohoto proteinu se může měnit v závislosti na stavu buněčné diferenciace, nebo to může být změněna během procesu maligní transformace . V naší studii na lidských kožních nádorů, jsme zjistili, že CD133 výraz je značně závislá na tvorbě potní žlázy kubický a potní žlázy. CD133 imunoreaktivitu bylo hlavně vidět na apikální/endoluminální povrchu potrubí-jako struktury nebo cysty z nejvíce benigní a maligní endokrinní nádory. Žádný ze studovaných nádorů, ani benigní ani maligní, nepředstavoval izolované nebo malé shluky CD133 pozitivních neoplastických buněk v pevných oblastech. Podobný vzor barvení CD133 apikální buněčné membrány sekrečních buněk byl dříve hlášen v normálních tubulárních strukturách, jako jsou proximální tubuly ledvin nebo v nádorových žlázách kolorektálního karcinomu . Barvení CD133 bylo také zjištěno na apikálním / endoluminálním povrchu buněk tvořících lumen u karcinomů vaječníků . V těchto případech bylo apikální umístění CD133 zapojeno do možné sekreční funkce této molekuly. Morfologické rozdělení CD133 barvení ukazuje korelaci s dobře uznávané sekreční struktury normální tkáně a žláz, což naznačuje, že funkční vztah CD133 s sekrece. Ve skutečnosti, v naší studii, nádory podezření, že vznikl v duktální oblasti potních žláz, jako syringomas, ukázal méně intenzivní vzor barvení než ty, které vznikly v acinárních porce.

exprese CD133 na buněčném povrchu diferencovaných nádorových buněk je argumentem proti CD133 jako specifickému markeru nádorových kmenových buněk v kůži. Existenci malé populace CD133+ CSC však nelze zcela vyloučit, jak bylo prokázáno v jiných orgánech, kde je CD133 exprimován na buněčném povrchu obou CSC a diferencovaných nádorových buněk .

společně naše nálezy ukazují specifickou imunohistochemickou expresi protilátky AC133 na sekrečním povrchu diferencovaných normálních a neoplastických buněk ekrinních žláz. Experimenty, které používají tuto protilátku jako marker CSC v kůži, by měly být interpretovány s opatrností. Protilátka AC133 je citlivý a specifický marker kožní žlázové diferenciace, užitečný pro diagnostiku nádorů s možnou ekrinní nebo apokrinní diferenciací.

Poděkování

autoři jsou vděční Pedro Javier Benito Castellanos a Laura Abendaño pro technickou podporu.