Laboratorní Poznámky k BIO 1003

© 30. srpna 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holandsku

ENZYMY

Proteiny, Které Působí Jako Katalyzátory,

(Klikněte zde pro: Materiály, schémata, Webové zdroje)

Buňky nemají možnosti, tepla a intenzivního míchání na rychlost chemické reakce tím, že atomy a molekuly narážejí do sebe častěji a s větší silou. Místo toho, aby bílkoviny, katalyzátory, nazývané enzymy, které poskytují plochy, na kterých reaktanty setkání ve správné orientaci, a enzymy, může dokonce oslabit vazby, které jsou, aby se porušovala. Enzymy mají vysokou specificitu-na jejich povrchy se vejdou pouze specifické reaktanty a vyrovnají místní povrchové náboje místa nazývaného Aktivní místo. Konkrétní sada reaktantů pro enzym se nazývá jeho substrát(y). Enzymy, stejně jako všechny katalyzátory, se nemění reakcí, kterou katalyzují; když jsou tedy všechny reaktanty převedeny na produkty, zůstávají původní molekuly enzymu.

funkce enzymu závisí na prostředí, ve kterém se reakce vyskytuje. Takové faktory, jako je teplota a pH, mohou výrazně ovlivnit schopnost enzymu vykonávat svou práci. Následující série experimentů ilustruje principy enzymaticky katalyzovaných reakcí v biologických systémech. Budeme používat enzym katecholázu (nebo katechol oxidázu), který je běžný v rostlinách; je přítomen v čerstvě vymačkané bramborové šťávě, která byla poskytnuta. Substráty katecholázy jsou katechol a kyslík. Substráty spolu reagují v aktivním místě enzymu. Produkty vytvořené touto reakcí jsou benzochinon a voda; protože benzochinon má hnědou barvu, můžete vidět, že reakce proběhla. Tomu se říká reakce na zhnědnutí ovoce. Benzochinon inhibuje růst mikroorganismů a zabraňuje hnilobě poškozeného ovoce. V nepoškozených buňkách je katecholáza uložena ve vezikulech a nereaguje s katecholem.

v přítomnosti enzymu katacholázy:

katechol + ½O2 benzoquinone + H2O

Ve všech experimentů níže, smíchat ingredience, jak je uvedeno, a směs se míchá s vortex genie nebo klepnutím na stranu trubice u dna; směsi inkubovat při teplotě 40 ° C, pokud není uvedeno jinak.

Pokud jste pochybovali o čistotě enzymu, jak byste mohli zjistit, zda je v bramborovém extraktu kromě katecholázy ještě něco jiného?

i. tvorba a detekce Benzochinonu

tento experiment stanoví standardy pro vzhled, když reakce proběhla nebo nedošlo. Použijte destilovanou vodu, kde je uvedeno H2O.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (ovládání)

Jak byste definoval pojmy kontrolní a experimentu?

II. enzymová specificita

hydrochinon je strukturálně podobný, ale není stejný jako katechol. V tomto experimentu uvidíme, zda ho enzym může také převést na benzochinon, nebo zda je enzym jednoduše příliš specifický ve svém designu, aby interagoval s podobnou, ale ne identickou molekulou.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control)

Může blokování enzymu cyklooxygenázy převést hydrochinon, aby benzoquinone? Jak jste k tomuto závěru dospěli?

poznámka: vaše skupina bude dělat buď III nebo IV-ne obojí.
Zeptejte se svého lab instruktor, zda vaše skupina bude dělat, III teploty nebo IV pH.

III. Vliv Teploty na Aktivitu Enzymu.

Enzymy jsou navrženy tak, aby funkce v určitém teplotním rozmezí. Můžete udělat nějaké odhady, pokud jde o výsledek následujících teplot níže. Mějte na paměti, že struktury, které produkují enzym jsou ovoce a brambory; na Celsia teplotní stupnice 0 ° c mrzne, 22 stupňů je pokojová teplota, a 100 stupňů je vařící. Čím je teplejší, tím rychleji molekuly vibrují a pohybují se. Srážky molekul vody s enzymem by mohly vrátit zpět jeho složenou strukturu, která je držena v poloze vodíkovými vazbami; když k tomu dojde, molekula se říká, že byla denaturována. Co by se stalo s aktivním místem v tomto případě? Při nízkých teplotách se molekuly pohybují velmi pomalu, a pravděpodobnost jejich kolize a reagovat s navzájem, je velmi nízká. Všimněte si, že bramborový extrakt byl uchováván na ledu. Proč?

zapište si své hypotézy o vlivu teploty na enzymové aktivity:

Set up 6 párů zkumavky s 10 kapek bramborového extraktu v jedné sadě a 10 kapek 1% katechol v druhé. Inkubujte je po dobu 5 minut, jeden pár v každém z 5 teplotních prostředí uvedených níže. Poté smíchejte bramborový extrakt a katechol dohromady; Zaznamenejte počáteční barvu a vložte tuto zkumavku zpět do prostředí s řízenou teplotou. Po 5 minutách znovu nahrajte barvu.

Teplota	Základní barva:	změna Barvy (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 stupňů C,
100 ° C

výsledky podporují počáteční hypotézu?

které teploty denaturují enzym tak, aby se nemohl zotavit.

jaká je bílá sraženina, která se tvoří při 100 stupních C?

IV. Vliv pH na Aktivitu Enzymu.

stupnice pH Se měří množství vodíkových iontů (každý s +1 zdarma) přítomné v roztoku. Stupnice v biologických systémech běží od 0 (silně kyselá) do 14 (silně zásaditá). 7, neutrální bod, je pH čisté vody. Připomeňme si, že složené struktury proteinových molekul je z velké části v důsledku vodíkové vazby mezi opačně nabitých částí polypeptidového řetězce. Jiné ionty v roztoku by mohly nahradit odpovídající části řetězce a způsobit, že se vrátí zpět. Když k tomu dojde, co se stane s aktivním webem?

zapište si svou hypotézu o vlivu rozsahu pH na aktivitu enzymu:

nastavte 7 zkumavek se 40 kapkami jiného pufrovaného pH roztoku v každé. Do každé přidejte 10 kapek bramborového extraktu a promíchejte. Poté přidejte 10 kapek 1% katecholu a promíchejte.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

při jakém pH nebo rozsahu hodnot pH funguje enzym nejlépe?

proč uvedení citronové šťávy na čerstvě nakrájené ovoce zpomaluje jeho zhnědnutí?

V. nutnost kofaktorů pro enzymovou aktivitu

mnoho enzymů funguje pouze v případě, že je s nimi spojen kofaktor. Katecholáza vyžaduje měď jako kofaktor. PTU je chemická látka, která má vyšší afinitu k mědi než katecholáza, a odvádí měď od enzymu. Můžete sledovat, co se stane s funkcí enzymu, když je jeho kofaktor odstraněn. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. po 5 minutách přidejte 10 kapek 1% katecholu.

jakou trubku, A nebo B, je kontrola v tomto experimentu?