Toto je první ze série tří částí na transformaci E. coli. Na konci toho byste měli být odborníkem na transformaci E. coli a na které kmeny si vybrat pro různé aplikace. Pokud jste již odborníkem, doufám, že to pro vás bude příjemné osvěžení. V obou případech, prosím komentář níže, pokud máte co přidat.

pomocí elektřiny pro transformaci

cizí DNA může být zavedena do Kompetentní E. coli pomocí elektroporace nebo chemické transformace. Při použití elektroporace aplikujete elektrický proud přes buňku. Aktuální je myšlenka vytvořit momentální „póry“ v buněčných membránách, které nutí negativně nabité DNA do buněk pomocí elektroforézy-typ účinek. Chcete-li vyrobit elektro-Kompetentní E.coli, důkladně omyjte buňky, abyste odstranili všechny střední soli. Tím je zajištěno, že náboj není veden přes médium. Také proveďte elektroporaci při 0°C, abyste minimalizovali tepelné poškození buněk.

chemikálie: pracují také

k výrobě chemicky kompetentních buněk, resuspendují E. coli v roztoku CaCl2 při 0°C. Za těchto podmínek, Ca2+ iontů je myšlenka k vytvoření pórů v membráně, pomoc, vazba DNA na buněčné membráně a maskovat negativní náboj DNA. Společně tyto usnadňují průchod DNA hydrofobní buněčnou membránou. Přinutit DNA do buněk použitím krátkého tepelného šoku 42°C, což má za následek tepelný proud, který zametá DNA do buněk.

Klady a Zápory Každého

Elektroporace je méně těžkopádný než chemické transformace a obecně dává vyšší účinnosti transformace (měřeno v koloniích tvoří na mikrogram DNA). Je však dražší. Vyžaduje speciální zařízení pro dodávání náboje a kyvety pro přenos náboje do buněčné suspenze. Elektroporace je citlivá na sůl – můžete ztratit vzácné vzorky, pokud je přebytečná sůl přenesena do kyvety.

osobně preferuji chemickou transformaci. I když to trvá asi půl hodiny déle, zjistil jsem, že výsledky jsou předvídatelnější a Líbí se mi skutečnost, že větší objem DNA lze přidat, pokud je koncentrace příliš nízká. Nemůžete zvýšit objem DNA elektroporací kvůli riziku přidání příliš velkého množství soli do roztoku. I když běžně citované nevýhodou chemicky transformace je jeho nižší účinnost, si nyní můžete koupit ultra-příslušné buňky, jako Stratagene je XL10-gold, takže už to není tak velký problém.

články v této sérii:

• elektroporace E. coli vs chemická transformace (tento článek)
• příslušný E. coli: koupit nebo nekupovat?
• výběr příslušného kmene E. coli

původně publikováno 18. září 2007. Revidováno a aktualizováno 11. července 2016.