Systémové agonistické rakovina imunoterapie vyvolává diferenciální expanze CD4 a CD8 T lymfocytů v lymfoidních a periferních orgánů

Kombinace anti-CD40 s IL-2 bylo prokázáno, že k vyvolání opožděné růstu a regrese v několika myších modelech nádorů . Podobné zveřejněných dat pomocí buněčné linie nádorové modely, ošetření mléčné intraepiteliální neoplazie-následek (MIN-O) model , tkáňové transplantaci, s anti-CD40 a IL-2 imunoterapie (TO) vedlo k významné protinádorové odpovědi (P = 0.0057), včetně regrese v >50% léčených myší (Další soubor 1: Obrázek S1A). Předchozí studie ukázaly, že tyto protinádorové odpovědi jsou způsobeny CD8 T buňkami, proto jsme hodnotili fenotyp T buněk ve slezině i v nádoru a plicích(běžné metastatické místo pro mnoho různých nádorových modelů). Zatímco jsme zaznamenali terapie obecně vyvolané expanze CD8 všech orgánů, jsme zaznamenali některé rozdíly v CD8 T buňky paměti fenotyp přes varhany lokalit (Další soubor 1: Obrázek S1B-C).

my a další Jsme už dříve ukázaly, že silné imunostimulační terapie pro rakovinu vyvolat silné šíření paměť (CD44high) CD4 a CD8 T buněk ve slezině a lymfatických uzlinách . Bylo také zjištěno, že CD4, ale ne CD8 T buňky také podstoupit aktivaci indukované buněčné smrti v interferon(IFN)-γ závislé módní což v nevýznamné celkové rozšíření počtu CD4 T-buněk tím, že čísla v těchto stejných orgánů ve srovnání s výchozí hodnotou . Tyto údaje byly generovány pomocí odečtů lymfoidních orgánů. Avšak ve světle fenotypů pozorovaných u myší léčených imunoterapií mohou být expanze, aktivace a apoptóza aktivovaných T buněk odlišně ovlivněny v periferních tkáních. Proto jsme se snažili dále charakterizovat a porovnat aktivaci T buněk v periferních orgánech (kde primárního nádoru a/nebo metastazující léze se mohou nacházet) a sekundární lymfatické orgány (které jsou často dotazovaných během imunoterapeutické studie k posouzení mechanismy působení). Hodnotili jsme frekvenci, expanzi a apoptózu CD8 a CD4 T buněk (Foxp3neg) systémově v lymfoidních i periferních orgánech. V souladu s předchozími zprávami naší skupiny, aniž by se významně změnila jejich celková frekvence (obr. 1a), anti-CD40/IL-2 imunoterapie vedla k významné expanzi celkového počtu CD8 T buněk ve slezinách a lymfatických uzlinách (obr. 1b). V souladu s nárůstem celkového CD8 čísla, frekvence CD8 T buňky, které jsou začleněny bromodeoxyuridine (BrdU) in vivo byl podstatně rozšířen a podíl apoptotických buněk hodnocené pomocí extracelulární Annexin V projevu nebylo významně odlišné od kontrol (Obr. C-D). Naproti tomu celková frekvence CD4 T buněk se snížila a čísla se významně nezměnila ve srovnání s kontrolami ve stejných orgánech (obr. 1a-b). Zatímco CD4 T buňky expandovaly, jak bylo hodnoceno začleněním BrdU, významná část z nich procházela také apoptózou (obr. 1c-d) což má za následek čistou nevýznamnou změnu celkového počtu. Tyto údaje byly v souladu s tím, co bylo dříve pozorováno . Když jsme posoudit non-lymfoidních orgánů, včetně plic a jater, viděli jsme podobné trendy v obou CD4 a CD8 T-buňky, a sice, že CD8 T buňky byly rozšíření a přežití všech orgánů následující (Obr. 2a-b) vzhledem k tomu, že CD4 T buněk (Foxp3neg) byly rozšiřující a současně bude prostřednictvím apoptózy v podobné míře, což v nevýznamné změny jejich frekvencí a čísel (Obr. 2c-d) na periferii.

T-buňka paměti fenotypy se liší mezi sekundární lymfatické orgány a periferní non-lymfoidní tkáně v CD8 T buněk, ale ne CD4 T buněk v návaznosti na TO

U myší, CD4 a CD8 T buňky mohou být dále roztříděny do paměti a naivní fenotypy na základě CD62L (L-selektinu) a CD44 výraz s CD44lowCD62L+ populace považuje za naivní (TN), CD44highCD62L+ populace považován za centrální paměti (TCM), a CD44highCD62Lneg populace za efektorové a/nebo efektorové paměťové (TE/EM). Je známo, že CD4 a CD8 T buňky se liší distribucí těchto podskupin v lymfoidních a periferních orgánech. Zatímco naivní frekvence v populacích CD4 a CD8 zůstávají relativně podobné, populace CD44high je více zkosená centrální paměť v CD8 T buňkách a efektorová paměť zkosená v CD4 T buňkách v klidovém organismu . V periferních orgánech jsou však T buňky rezidentní v tkáni v podmnožinách CD4 i CD8 T buněk převážně fenotypu efektorové paměti .

Předchozí studie ukázaly, že paměť fenotyp buněk (CD44high) hlavní typ buňky rozšiřuje následující stimulační imunoterapie . Abychom lépe porozuměli složení CD4 a CD8 T buněk napříč různými orgány, vyhodnotili jsme jejich stav fenotypu paměti v každém orgánu po něm. V klidu, CD44high populace CD8 T buněk v lymfoidních orgánech byl převážně TCM (>90%) vzhledem k tomu, že v periferních orgánech, to byla kombinace s ~60% TCM (Obr. 3a, c, e, – f). Obecně to vede k celkové expanzi Cd44vysoká frekvence ve všech orgánech. Frekvence TCM byly buď nezměněny nebo mírně zvýšeny, zatímco populace TE / EM se významně rozšířily (obr. 3e-f) od ~10% do 30% v lymfoidních orgánech a působivě od ~30-85% v periferních orgánech.

V CD44high populace CD4 T buněk, spočívající myši byly více silně vychýlená směrem k TE/EM fenotyp s přibližně 60-70% v lymfoidní a 75-95% v periferních tkáních (Obr. 3b, d). Jak se stalo v CD8 T buněk, a TO po CD44high podíl rozšířil, ale vzhledem k tomu, že to bylo tak silně vychýlena TE/EM fenotyp všech orgánů v klidové myši, frekvence CD4 TE/EM byly do značné míry konzistentní napříč všech orgánů v NÍ léčených myší (Obr. 3e). Frekvence TCM CD4 zůstaly relativně nízké a konzistentní ve všech orgánech, a to jak před, tak po IT (obr. 3f).

Exprese aktivačních markerů v CD4 a CD8 T buňky je závislá na umístění a paměť fenotyp

kromě toho rozdíly V proliferaci a apoptózu, máme také běžně si všiml, že CD4 a CD8 T buňky rozdílně upregulate aktivační a inhibiční molekuly následující. Nejvýraznějším příkladem tohoto je PD-1, které, na základě studií se zaměřením na sekundární lymfatické orgány (slezina a LN), byla přednostně přesměrován na CD4 a ne CD8 T-buňky, a myslel, že se pravděpodobně podílí na preferenční AICD proces, který nastal v CD4 ale ne CD8 T buňky následující . Dalším příkladem může být preferenční upregulace NKG2D na CD8 T buněk, ale ne CD4 svěřují divák vyvolané lytické schopnosti po silném cytokinů vystavení paměťové CD8 podmnožinu. Předchozí studie naší laboratoře a údaje uvedené na obr. 3 ukázaly, že mezi CD4 i CD8 T buňkami jsou primární buňky, které aktivně proliferují a reagují na ně, fenotypové buňky CD44high memory . Proto jsme se dále zaměřili na tuto populaci.

V CD44high populace, bylo prokázáno, že proliferující CD8 T buňky nedokáží upregulate markery konzistentní s aktivaci antigen specifické stimuly, jako jsou CD25 a PD-1, ale upregulate značky, které jim umožní získat divák fenotyp, a to NKG2D, které jim propůjčují schopnost jednat více v NK-jako antigen neomezeným způsobem. Naopak, CD44high, proliferující (Foxp3neg) CD4 T buňky neúměrně upregulate PD-1 (v kontrastu k CD8 T buněk a Foxp3+ regulační CD4 + T buňky), které jsme navrhli jim umožňuje být přednostně zaměřena na indukci apoptózy . V souladu s těmito předchozí zprávy, jsme pozorovali podobné fenotypy mezi sleziny a lymfatických uzlin rezidenta, zacházeno CD44highCD8+ T buněk, což výrazně upregulated NKG2D, ale ne PD-1 (Obr. 4a, c) a CD44highCD4+ T buňky, které robustně upregulovaly PD-1, ale ne NKG2D (obr. 4b, d). Když jsme hodnotili stejné fenotypové markery v T buněčných populací obyvatel do periferní, non-lymfoidní orgány, CD44highCD8+ T buňky fenotyp byl značně odlišné od těch, bydliště do sekundárních lymfoidních orgánů. Zatímco CD44highCD8+ T buňky rezidentní v plicích a játrech byly stále NKG2D+CD25neg (obr. 4a, c), frekvence NKG2D+ buněk v této populaci se objevil na zvýšení, z 20-30% v lymfoidních orgánech na 40-50% v periferních orgánech (Obr. 4a). Kromě toho, na rozdíl od lymfoidních orgánů, kde se exprese PD-1 nezměnila, byla exprese PD-1 významně zvýšena jak v plicích, tak v játrech po ní v populaci CD44highCD8+ (obr. 4c). Naopak fenotyp CD44highCD4 T buněk byl pozoruhodně podobný CD4 T buňkám sleziny a lymfatických uzlin napříč všemi orgány (obr. 4b, d) se srovnatelnou expresí PD-1 a minimální upregulací NKG2D. CD25 nebyl upregulován v CD4 nebo CD8 T buňkách na jakémkoli místě(údaje nejsou zobrazeny). To bylo nečekané, protože jsme již dříve navrhl, že rozdílná exprese PD-1 je pravděpodobné, že základní mechanismus diferenciální indukce apoptózy mezi CD4 a CD8 T buňky následující silné, imunostimulační TO režimy. Přesto v periferních orgánech jsou CD4 T buňky nadále neúměrně ovlivněny apoptózou navzdory skutečnosti, že exprese PD-1 je srovnatelná mezi CD4 a CD8 T buňkami. Tento vzorec, který se objevil, byl také zajímavý, protože se zdálo, že zvýšená exprese aktivačního markeru na periferii přímo koreluje s převahou TE/EM, zejména v případě PD-1.

v poslední době bylo prokázáno, že cirkulující TE/EM buněk exprimuje zvýšené hladiny PD-1 v klidové lidí . Proto jsme předpokládali, že CD8+ TE/EM buňky mohou být přednostně vyjádření těchto aktivačních markerů v průběhu CD8+ TCM, což v diferenciální frekvence CD44highCD8+ T buněk exprimujících aktivační markery v sekundárních lymfoidních a periferních orgánů. Proto jsme vyhodnotili expresi NKG2D a PD-1 na CD8 + CD44highCD25neg TE / EM a TCM buňkách napříč všemi orgány u klidových a IT ošetřených myší. U kontrolních myší oba NKG2D (obr. 5a) a PD-1 (obr. 5c) byly exprimovány s vyšší frekvencí na podskupině TE / EM populace CD8+CD44highCD25. Celková frekvence populace TE / EM mezi CD8+ T buňkami u klidových myší je však relativně nízká ve srovnání s TCM (výsečové grafy obr. 5a), proto je celkově exprese jak PD-1, tak NKG2D převážně nízká (obr. 4) protože TCM tvoří většinu CD8+ T buněk v klidu. U myší léčených imunoterapií byla exprese NKG2D i PD-1 zvýšena ve všech orgánech (obr. 4). Opět oba NKG2D (obr. 5b) a PD-1 (obr. 5d) byly exprimovány více vysoko na TE / EM CD8+ T buňkách než TCM CD8+ T buňkách. V lymfoidních orgánech, kde se populace TE / EM rozšířila ve srovnání s kontrolou, byla stále významně nižší než buňky CD8+ TCM (koláčové grafy, obr. 5b) což má za následek méně významné expanze na těchto místech. Na rozdíl od lymfoidních orgánů tvořily buňky CD8+ TE / EM většinu testovaných periferních orgánů (koláčové grafy, obr. 5b), čímž se celková exprese NKG2D a PD-1 významně zvýší na těchto místech. Opět je důležité si uvědomit, že v lymfoidních orgánech imunoterapie léčených myší, celková exprese obou aktivačních markerů byla výrazně nižší než v periferních orgánech vzhledem k TCM zkreslení v lymfatického systému přes periferii v CD8 populace. Vyjádření úrovně neměl výrazně lišit mezi TE/EM z různých orgánů (tam byly žádné významné rozdíly mezi lymfoidní a periferních orgánů) v rámci stejné zacházení skupin, ale obecně zvýšení TO léčených ve srovnání s kontrolou, trend, který byl výrazně více vyslovováno s NKG2D než PD-1 (Obr. 5). Naproti tomu exprese aktivačního markeru TCM zůstala relativně konstantní nejen mezi orgány myší v léčené skupině, ale také mezi kontrolními a IT léčenými skupinami (obr. 5a-b). Dohromady tyto údaje naznačují, že ústava paměť/aktivní bazén (TCM vs TE/EM) silně váží na fenotyp z aktivovaných T buněčné populace, zejména s CD8 T buněk jako jejich ústava se značně liší mezi lymfoidní a non-lymfoidních orgánů.

Hodnocení T-buněk u pacientů léčených vysokými dávkami systémových imunostimulační terapie

dále jsme chtěli posoudit, zda tyto výsledky přeloženo do lidské pacientů léčených imunostimulační terapie pro rakovinu. V současné době neexistují žádné studie posouzení kombinace agonistické anti-CD40 s rekombinantní lidský IL-2 však máme běžně ve srovnání naši kombinační terapie s jinými systémové imunostimulační ošetření, včetně vysoké dávky TLR agonistů a vysoké dávky systémových cytokinové terapie a zobrazeno podobné fenotypové a funkční změny T-buněk, jako jsou pozorovány v našich preklinických model . Posoudit, zda pacienti na klinice zobrazeno podobné změny v povrchových markerů výraz, shromáždili jsme periferních krevních mononukleárních buněk (Pbmc) z metastatického melanomu u pacientů podstupujících systémové vysoké dávky IL-2 terapie. Pacienti dostávali 6×10^5 IU / Kg každých 8 h pro plánované celkem 14 dávek. PBMC vzorky byly odebrány jeden den před zahájením terapie (základní) nebo na 8. den prvního cyklu léčby (den 8) posoudit, T buněčného fenotypu. Porovnání směrného plánu a dne 8 vzorků, došlo k výraznému nárůstu PD-1+ paměť fenotyp (CD45RO+) buněk v CD4 a CD8 T buňky podskupin tyto vysoké dávky IL-2 terapie (Obr. 6a-c). Když se tato populace byla dále člení do centrální paměti (CD62L+) a efektorové/effector memory (CD62L-) na den 8 časový bod, efektorové/effector memory podmnožina vyjádřil výrazně vyšší, PD-1 exprese, než centrální paměti podmnožina (Obr. 6d-e). Společně tyto údaje korelují s tím, co bylo pozorováno ve studiích na myších, což naznačuje, že tyto údaje jsou použitelné pro studie na lidech a mohou být indikátorem toho, co se vyskytuje lokálně.