Abstrakt
Stávající chemotaxe testech nebudou generovat stabilní chemotaktické přechody, a tak—v průběhu času—funkčně opatření pouze nespecifické náhodný pohyb (chemokinesis). V porovnání mikrofluidní technologie má schopnost generovat pevně kontrolované mikroprostředí, které mohou být stabilně udržuje po delší dobu a je proto vhodný k adaptaci pro prubířství chemotaxe. Popíšeme zde nové mikrofluidní zařízení pro citlivou testu buněčné migrace a ukázat jeho použití pro hodnocení chemotaxe buněk hladké svaloviny v chemokinový gradientu.
1. Úvod
řízená migrace buněk hraje rozhodující roli při zánětlivých poruchách, vaskulárních onemocněních, hojení ran a nádorových metastázách . Řada in vitro přístupy byly vyvinuty pro kvantifikaci buněčné migrace, včetně uzavření jednovrstvé rány („scratch test“) a Boyden komory . Tyto současné metody jsou však relativně necitlivé. Navíc takové přístupy mohou ve skutečnosti měřit pouze chemokinezi, tj.
ve skutečnosti je užitečnost scratch assay a Boyden chamber transwells omezena jejich metodologickým designem.
scratch assay, definované „rána“ (nuly) je vyroben v splývající buňky jednovrstevné; buňky na okrajích defektu pak postupně vyplnit prázdnotu, a čas obnovit soutoku je kvantifikovat. Rychlejší Oprava poškrábání byla interpretována tak, aby odrážela zvýšenou „chemotaxi“ v důsledku manipulace s buňkami nebo povahy rozpustných činidel přidaných do média. Při experimentu je koncepčně jednoduchá a technicky snadno proveditelné, buňky jsou zalité v jednotné koncentraci agent, a není tam žádný chemoattractant koncentrační gradient v průběhu celého experimentu; pohyb, který vyplňuje mezeru proto představuje pouze „náhodnou procházku.““Migrace“ v testu scratch je tedy do značné míry funkcí pouze zvýšené chemokinézy. Navíc, jak se obvykle provádí-zejména během několika hodin prodlouženého testu-uzavření „rány“ škrábanců také pravděpodobně zahrnuje podstatnou složku buněčné proliferace.
Další nejběžnější metoda měření „chemotaxe“ zahrnuje použití Boydenových komorových transwellů. Různé koncentrace specifických chemokines jsou umístěny ve spodní části zařízení, zatímco buňky, které mají být hodnoceny, jsou inkubovány v horní vložka; mikroporézní membrána odděluje dvě komory a tvoří podporu pro růst buněk a částečnou bariéru pro migraci. Buňky, které se počítají na spodní straně membrány nebo které se hromadí ve spodní komoře, se obvykle hodnotí v jediném pevném koncovém bodě. Tento test má výhodu zjevné řízené migrace, to znamená z horní do dolní komory, ale je stále problematický. Za prvé, neexistuje žádný“ gradient “ chemokinů shora dolů, ale spíše pouze funkce jednoho kroku od nízkých po vysoké koncentrace. Za druhé, neexistuje způsob, jak udržet chemokinový diferenciál od horní k dolní komoře . Zpočátku, chemokinový koncentrace v dolní části je větší, ale během minut až hodin, koncentrace vyrovnání v důsledku difúze, na kterém místě konkrétní chemotaxe přestane. Místo toho dlouhodobá měření s větší pravděpodobností odrážejí významný prvek chemokineze. Navíc, jakmile buňky spadnou přes membránu a do spodní komory, neexistuje žádná příležitost pro reverzní migraci. Nakonec je Boydenova komora také omezená, protože počítání buněk vyžaduje ukončení experimentu; časový průběh proto vyžaduje více zařízení.
mikrofluidní technologie může překonat tato omezení generováním dlouhodobě stabilního a kontrolovatelného gradientu rozpustných faktorů, které lze průběžně sledovat v průběhu času . Použití buněk, které byly ošetřeny k blokování proliferace, takové zařízení umožňuje skutečné průběžné hodnocení chemotaxe versus chemokineze. Obrázek 1 znázorňuje takové zařízení, kde zdrojem a dřezem koncentrace jsou udržovány vytváření odpovídajících jamek, jejichž objemy jsou velké vzhledem k difuzní tok přes připojení hydrogel kanálu . V ustáleném stavu se mezi těmito dvěma jamkami vytvoří lineární koncentrační gradient. I když intersticiální průtok hydrogel regionu může narušit gradient-li hydrostatické tlaky v obou studní nejsou stejné, tlakové gradienty jsou eliminovány spojující zdroj a potopit studny s dalšími kanálů a nádrží, které slouží jako nízký odpor cesty pro průtok kapaliny a tlaku v rovnováze. Gradienty tak mohou být udržovány několik dní a použity ke studiu migrace buněk citlivým a specifickým způsobem s různými typy buněk . Předkládaná práce zde popisuje pomocí takových zařízení, posoudit, chemotaxe pro primární kultury buněk hladké svaloviny a porovnat ji s poškrábání a Boyden komory technik na citlivost.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) dolní 3 jamky jsou buněčné a / nebo zdrojové jamky pro chemokiny a horní 3 jamky slouží jako zásobníky pro udržení ekvivalentních tlaků ve spodních jamkách. V závislosti na experimentální design, boční studny nebo ústřední dobře může sloužit jako zdroj wells; buňky v centru tak mohou přejít k jiné chemokinový podněty na obou stranách, nebo různé buněčné populace v boku studny může migrovat směrem k centrální chemokinový stimul. (b, c) Koncentrační gradienty jsou schematicky znázorněny po přidání nízké molekulové hmotnosti fluorescenční barvivo ukazatel na zdroj, no a zdroj nádrže, buď 2 hodin (b) a 72 hodin (c). d) grafické zobrazení koncentračních gradientů od 0 hodin do 72 hodin po přidání fluorescenčního barviva do zdrojové studny a nádrže.
2. Materiály a metody
2.1. Primární Buňky Hladké svaloviny (SMC) Kultura
Aort byly sklizeny z 8-týden-staré C57/B6 myší (Charles River, Wilmington, MA) s sterilní pitevní nůžky. Přilnavý tuk byl odstraněn, a aort byly inkubovány po dobu 20 min při 37°C v Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) obsahující 1% penicilin/streptomycin, 2% fetálního bovinního séra a 5 mg/mL kolagenáza typu II (Invitrogen). Aort byly opláchnout ve studené DMEM a adventitia byl pečlivě pitval dál; byli pak nakrájíme na malé kousky a inkubuje 30 min při 37°C v DMEM obsahující 1 mg/mL kolagenáza typu I (Invitrogen) a 0,125 mg/mL elastáza typ III (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Po opakované pipetování oddělit tkáně, výsledná buňka směs byla pozastavena v čerstvé „SMC střední“ (DMEM s 10% fetálního bovinního séra, 1% penicilin/streptomycin; 2% neesenciálních aminokyselin, 1% L-glutamin; všechny reagencie od Invitrogen) a pěstovány při 37°C v 5% CO2 inkubátoru na desky potažené 1 mg/mL fibronektinu po dobu 30 minut. Jakmile je buněčná kultura zavedena (obvykle po prvním průchodu), SMC se pěstují na nepotažených plastových baňkách (Corning Incorporated, Corning, NY).
SMC byly použity z pasáží 2 až 7 a byly 99.5% čisté, jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií po barvení α-aktinu hladkého svalstva. Pro barvení se buňky sklízejí a fixují 1% paraformaldehydem (Sigma-Aldrich) ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS). FITC-konjugovaná protilátka α-aktinu proti hladkému svalu (Sigma-Aldrich) při 1: 100 ředění v 10x BD perm/promývacím pufru (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornie) byla aplikována po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Buňky se promyjí dvakrát s 1% fetální bovinní sérum v PBS a jednou s 1% fetální bovinní sérum v PBS obsahujícím 1% formaldehydu a ihned analyzovány pomocí průtokové cytometrie (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-konjugovaný myší IgG1 isotyp (BD Pharmingen) se používá jako kontrola izotypu. Buňky pro chemotaktické testy byly odebrány, když dosáhly soutoku.
2.2. Mitomycin-C Léčba
Buňky byly trypsinized (o 0,25% trypsin-EDTA; Invitrogen) po dobu 2 min při 37°C, promyta SMC střední, a pak inkubovány jako jednobuněčné suspenze v 40 µg/mL mitomycin C (MMC; Sigma-Aldrich) v SMC střední 30 min při 37°C. Po další dvě promytí v PBS, buňky byly posouzeny pro životaschopnost, šíření, nebo migrační kapacity. Pro hojení ran (nuly) testu, MMC léčby bylo provedeno po SMC pokovování a když buňky byly 100% splývající; buňky byly inkubovány ve 40 µg/mL MMC v SMC střední 30 min při 37°C a poté se promyje dvakrát v PBS před provedením testu.
2.3. Test inhibice proliferace SMC
po ošetření MMC nebo kontrolní inkubaci v SMC médiu byl SMC kultivován v 6-jamkových destičkách (začleněno do Corning). Buňky byly získány po 1 h, 24 h nebo 48 h trypsinizací a počty buněk a životaschopnost byly hodnoceny počítáním pomocí hemocytometru a vyloučení trypan modré.
2.4. Hojení ran/Scratch Assay
SMC byly kultivovány v 12-destičky (Corning Incorporated) až splývající, a pak se zpracuje s MMC. Po umytí, čerstvé SMC médium bylo přidáno a buněčné monovrstvy byl poškrábaný reprodukovatelným způsobem pomocí sterilní 200 µL pipety. Různé koncentrace růstového faktoru odvozeného od krevních destiček (PDGF; R&D Systems, Minneapolis, MN) v médiích SMC byly přidány do každé jamky. Vzdálenost mezi okraji defektu poškrábání byla měřena a zprůměrována z pěti samostatných bodů ve 3, 6 a 9 h, nebo dokud se defekt rány nezavřel.
2.5. Boyden Komory Transwell Assay
100 µL SMC suspenze v 1.0–1.5 × 105 buněk/mL (1.0–1.5 × 104 celková buněk) byly vloženy do horní části transwell inserts (Costar, Corning Incorporated) a 600 µL SMC médiích obsahujících různé koncentrace PDGF byly umístěny v dolní části prostoru. Po 6 h, 12 h nebo 24 h inkubace, transwell membrány byl barveny Hoechst 33342 (Invitrogen) podle doporučení výrobce, a transmigrated buňky na spodní části obličeje byly počítány na fluorescenční mikroskop pomocí MetaMorph NX Mikroskopie Automatizace a Analýzu Obrazu Software (BioCompare, South San Francisco, CA). V médiu v dolní komoře nebyly nikdy identifikovány žádné buňky. V pokusech posoudit, zda migraci buněk zastoupeny chemotaxe nebo náhodné chemokinesis v nepřítomnosti koncentrační gradient, destičkový růstový faktor-BB (PDGF) byl přidán do dolní komory, horní vložit pouze, nebo obojí top vložit a dolní komory.
2.6. Test mikrofluidního zařízení
mikrofluidní zařízení (Obrázky 1(A) -1 (c)) se připraví tak, jak je popsáno jinde . Jak je znázorněno na obrázku 1(d), gradienty přidaných činidel jsou stabilní po dobu nejméně 72 hodin. V závislosti na experimentálním protokolu jsou buňky, které mají být vyhodnoceny, umístěny do centrální jamky a z obou bočních jamek se vyvinuly různé chemotaktické gradienty. Alternativně, migrace dvou různých populací buněk, může být hodnocena ze strany wells, zažívá stejné koncentrační gradienty generované činidla umístěny v centru. Koncentrace buněk byly vždy 4-5 × 105 / mL a 40 µL buněčných suspenzí (1,6-2,0 × 103 buněk) bylo vloženo do zkušebních jamek.
buňky byly inkubovány v zařízeních pro různé časové body a poté obarveny Hoechst 33342 (Invitrogen). Umístění každé buňky bylo stanoveno pomocí fluorescenční mikroskopie (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY) a migrovaná vzdálenost byla hodnocena pomocí programu Matlab (MathWorks, Natick, MA). „Celková migrace“ je definována jako součet vzdáleností migrovaných všemi buňkami za počátečním výchozím místem; tento migrační index se používá pro statistickou analýzu (Obrázek 2).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Hodnocení migraci buněk v mikrofluidních zařízeních. Buňky byly naneseny v centrální nižší dobře, mikrofluidní zařízení, s 50 ng/mL PDGF v SMC střední umístěn v levém dolním no a SMC médium umístěné v pravém dolním dobře, následuje inkubace při 37°C po dobu 48 h. (a, b) Fázový kontrast obrazu buněčné chemotaxe z centrálního kanálu ve směru 50 ng/mL PDGF v levý kanál; obrazy jsou rozděleny podél kanálu mezi dřezem a zdroj studny, takže po celé délce kanálu může být zobrazen při zvětšení dostatečnými pro mobilní rozlišení. (c, d) fázový kontrastní obraz buněčné chemokineze z centrálního kanálu pouze ve směru SMC média. (e, f) nízkoenergetický fluorescenční obraz levého (e) nebo pravého; (f) kanálu po 48 hodinách po obarvení Hoechst 33342. (g) High-power fluorescenční obraz levého kanálu v panelu (e); černé čtverce, aniž by buňky v blízkosti pravé straně obrázku (hvězdička) je strukturální post, který označuje počáteční bod migrace. h) příklad migrační analýzy. Svislá červená čára označuje počáteční bod, vzdálenost od výchozího bodu ke středu každého buněčného jádra je měřena, a součet všech těchto jednotlivých měření se stává celkový migrační vzdálenost v Matlabu.
Kolagenu typu I (Invitrogen) se používá k vyplnění kanálu mezi centrální a boční vrty, a je substrát, jehož prostřednictvím buňky migrovat. Lze použít jak 1 mg/mL, tak 2 mg/mL kolagenu. I když 1 mg/mL kolagenu má za následek poněkud vyšší nespecifické pozadí buňky chemokinesis a zavádění do gelu je technicky obtížnější než s 2 mg/mL kolagenu, tím nižší koncentrace kolagenu umožňuje větší migrace primárních kultur SMC, a test citlivost je lepší. Pokud není uvedeno jinak, koncentrace kolagenu v migračních kanálech byla 1 mg / mL pro všechny experimenty.
2.7. Statistická analýza
statistická srovnání byla provedena pomocí Studentova testu nebo jednosměrné ANOVA. Význam byl definován na úrovni.
3. Výsledky a diskuse
jak je znázorněno na obrázku 3(a), buněčná proliferace je blokována léčbou MMC. Není významný rozdíl v životaschopnosti buněk mezi SMC léčeným MMC ( % ) a neléčeným SMC ( % ) po dobu až 48 hodin po léčbě. Akumulace buněk v různých migračních testech tedy představuje skutečný pohyb buněk bez jakékoli složky buněčné proliferace. To je důležité, protože bez léčby MMC mohou být migrační indexy z dlouhodobých inkubací zmateny náhodnou buněčnou proliferací.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
buněčná migrace v scratch a Boyden komory testy. (a) Mitomycin – C (MMC) inhibice proliferace SMC. SMC ošetřené s nebo bez MMC (40 µg / mL po dobu 30 minut při 37°C) byly naneseny do 6 jamkových desek a následně sklizeny. Počty buněk byly ručně provedeny na hemocytometer po 1 h, 24 h a 48 h; počty buněk jsou vyjádřeny jako průměr ± jedna směrodatná odchylka kopie. Vyloučení trypan blue neprokázalo žádné rozdíly v životaschopnosti buněk během 48 hodin (%). Léčba MMC vede ke stabilnímu počtu buněk odebraných za 24 hodin a 48 hodin s významně zvýšenou proliferací v populacích neléčených MMC (). b) Scratch test; nebyly pozorovány žádné rozdíly v rozsahu migrace mezi buňkami kultivovanými v chemokinu no versus 25-100 ng/mL PDGF; během 3-6 hodin tohoto testu nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi kontrolními buňkami a buňkami léčenými MMC. (c) Transwell assay; různé koncentrace PDGF byly přidány do dolní komory transwell zařízení v čase nula; buňky na spodním aspekt transwell vložky byly vyčísleny po 6 h, 12 h nebo 24 h. Ve srovnání s žádným PDGF ve spodní komoře byl po 12 h () významně větší počet migrovaných buněk ve skupině PDGF 10 ng/mL, 25 ng/mL a 50 ng/ml. Po 24 hodinách se počet migrovaných buněk v transwells s 5-50 ng/mL PDGF významně nelišil ve srovnání s komorami bez PDGF. Po 24 hodinách byly migrované počty buněk, když bylo ve spodní komoře přítomno 100 ng/mL PDGF, významně sníženy ve srovnání s kontrolní skupinou PDGF 0 ng / ml. d) Chemokineze v transwells; stejné 50 ng/mL koncentrace PDGF byl vložen do spodní komory, horní komora, nebo obě dolní a horní komory; migraci buněk byla analyzována po 6 h, 12 h nebo 24 h. Vzhledem k ne PDGF komory, buněčnou migraci významně vyšší u 50 ng/mL v dolní sněmovně ve 12 hodin (); do 24 hodin, tam byl žádný významný rozdíl mezi kontrolní komory a 50 ng/mL PDGF. Zejména, přidání PDGF do horní komory, s nebo bez PDGF v dolní komoře, vedl k výrazně zvýšené migrace ve 12 hodin, vzhledem k PDGF v dolní komoře sám ().
scratch testy (viz Obrázek 3(b)) s primární SMC kulturách, buňky náhodně stěhovali (chemokinesis) k vyplnění vady na srovnatelné sazby bez ohledu na to, PDGF koncentrace, včetně v nepřítomnosti jakékoli chemotaktické agent. Bez ošetření MMC mají vady rány tendenci se uzavřít o něco dříve, což naznačuje prvek buněčné proliferace.
obrázek 3(c) ukazuje výsledky migrace pro SMC pomocí testu Boyden chamber transwell. Časný (12 h) časový bod ukazuje malou, ale významně zvýšenou migraci v reakci na 10-50 ng/mL PDGF oproti žádnému chemokinu ve spodní jamce. Nebyl však žádný rozlišitelný rozdíl v migraci v rozmezí 10násobné koncentrace PDGF, což naznačuje, že test je relativně necitlivý, alespoň pro primární SMC kultury. Navíc, do 24 hodin, nejsou tam žádné rozdíly mezi koncentrací chemokines (včetně střední kontrola), což naznačuje, že migrace v tomto časovém bodě je nespecifické, jakmile koncentrace cytokinů začaly rovnovážného stavu mezi horní a dolní části studny.
formálně prokázat, že migrace přes membránu v horním no není nutně kvůli režie chemotaxe, PDGF byla přidána do horní no, s nebo bez PDGF v dolní části prostoru. I při absenci chemokinového gradientu vedlo PDGF v horní komoře k výrazně zvýšené transmigraci (obrázek 3(d)); To lze připsat pouze zvýšené chemokinezi.
transwell pokusů tedy naznačují, že i když počáteční koncentrace PDGF rozdíly mohou vyvolat určitý stupeň zvýšil migraci buněk směrem k vyšším koncentracím ve spodní studny, následné PDGF difúze vede k náhodné chemokinesis.
pro srovnání, experimenty s dávkou a odpovědí za použití mikrofluidních zařízení (obrázek 4) prokazují významnou chemotaxi při koncentracích až 2.5 ng / mL PDGF(obrázek 4 (B)) a vykazují na dávce závislé zvýšení chemotaxe s maximem přibližně 25-50 ng / mL(Obrázek 4 (a)). Je zajímavé, že vyšší koncentrace PDGF (např. 100 ng/mL) vedou k menší migraci, což je v souladu se zastavením vysoké dávky chemotaxe (18). Z vědomí, že bez předchozího MMC léčby, migrační index je větší (Obrázek 4(a)), zvýraznění nezanedbatelnou příspěvek proliferace na „zřejmé“, chemotaxe vyskytující se delší test krát. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or „gold standard“ Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. (a) křivky odpovědi na dávku s předchozí léčbou MMC a bez ní. MMC ošetřené a neošetřené SMC byly umístěny do jamek postranních buněk s různými koncentracemi PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL a 100 ng/mL) přítomných v jamkách centrálního zdroje. Migrace byla měřena po barvení Hoechst 33342 a fluorescenční mikroskopii po 48 hodinách pomocí programu Matlab pro výpočet celkové migrace. Kontroly (pouze médium SMC) a každá koncentrace PDGF byly hodnoceny v trojím vyhotovení. Významné rozdíly lze pozorovat od 5 ng / mL do 100 ng / mL PDGF ve srovnání s kontrolou (). b) Chemokineze versus chemotaxe v mikrofluidních prostředcích. MMC-ošetřena SMC s nebo bez 2.5 ng/mL PDGF byly naneseny v centrální buňka; 2.5 ng/mL nebo 50 ng/mL PDGF byly přidány na straně zdroje studny. Bez PDGF přítomen v centrální buňce no, test ukazuje výrazně větší celkové migrace po 48 h s 50 ng/mL ve zdroji („0-50“) versus 2.5 ng/mL ve zdroji („0-2.5“). Přítomnost 2,5 ng / mL PDGF v centrální buněčné jamce vede k výrazně větší celkové migraci, pokud existuje koncentrační gradient („2,5-50“; ) přičitatelné lokálnímu chemokinetickému účinku. Při absenci gradientu („2,5-2,5“) dochází k migraci spojené s chemokinezí, která je významně menší než migrace pozorovaná při přítomnosti gradientu („0-2, 5“;). (c) experiment s časovým průběhem provedený jako panel (b).
nejen, že mikrofluidní zařízení být použit pro měření chemotaxe, ale také to může konkrétně rozlišit příspěvky chemokinesis a chemotaxe k migraci (Obrázek 4(b)). Tedy při absenci chemokinového gradientu (např. 2.5 ng / mL PDGF ve středových i bočních jamkách), migrační index odráží chemokinezi. Ve srovnání s ne PDGF v centru no a 2,5 ng/mL ve straně dobře, migrační index odráží režie chemotaxe. Na mikrofluidní zařízení může také posoudit, chemotaxe v přítomnosti existující chemokinesis, jako když centrum no obsahuje 2,5 ng/mL, PDGF a strana tak obsahuje 50 ng/mL. Existuje malá, ale statisticky větší migrace, pokud je stimulem chemotaktický gradient spíše než jednoduchá chemokineze.
vzhledem k tomu, že chemokinový gradient je stanoven během 2 hodin (17) a je stabilní po dobu několika dnů, mohou buňky kontinuálně migrovat koncentrační gradient v průběhu času (obrázek 4(c)). Ve srovnání, ostatní klasické metody buď nemají žádné koncentrační gradient (scratch test) nebo jen přechodné chemokinový gradient, takže chemokinesis—spíše než režie chemotaxe—je stále více přispívat.
mikrofluidní zařízení hlášeny v této práci je lepší v mnoha ohledech ve srovnání s jinými in vitro přístupy dříve používané ke studiu chemotaxe. Zejména Boyden komory—zahrnující chemokinový gradientu přes porézní membránu byla standardní chemotaktické assay od roku 1950. Nicméně, toto zařízení má významné omezení v tom, že přechody nejsou ani stabilní, ani lineární, s počátečním ostré koncentrace krok nahoru, která se postupně zhoršuje v průběhu času. V poslední době, mikro-elektromechanické systémy (MEMS) technologie byly vyvinuty, které využívají mikrofluidní biočipů napodobit podmínky in vivo; v těchto zařízeních, buňky jsou neustále vystaveni smykové síly podle řízený tok. Kontinuální tok těchto zařízení však představuje výzvu pro udržení stabilních chemokinových gradientů. I když hydrogely mezi zdrojem a dřezem kanál můžete vytvořit lineární koncentrační gradienty , jemné rozdíly ve studní a kanálů může vyvolat tlakové gradienty, které narušují přechody přes intersticiální toku ; navíc, kontinuální průtok zařízení má tendenci k ředění nějaké chemoattractants vylučovaný mobilní zdroje. V románu mikrofluidní zařízení je popsáno dříve a ověřeny pro hladké svalové buňky migrace v této knize, velký objem zdroj a potopit wells udržovat stabilní chemokinový přechody v připojení hydrogel; žádné intersticiální tok je eliminován připojením na zdroj a potopit studny s dalšími kanálů a nádrží, které slouží jako rezistor-kondenzátor v obvodu. Koncentrační gradienty jsou tedy stabilní a lineární po dobu několika dnů. Současná práce má další rafinované aplikace, zahrnující mitomycin-C léčby, aby se snížilo žádné matoucí příspěvek proliferace a ukazuje, jak chemotaxe a chemokinesis může být hodnocena ve stejné experimentální nastavení.
střet zájmů
autoři prohlašují, že žádný střet zájmů nemají.
poděkování
tato práce byla podpořena grantem BWH-Bri Fund na udržení excelence ve výzkumu-Bridge Research Grant. Chen Zhang byl podporován čínskou stipendijní radou po dobu 18 měsíců. Ovid C. Amati a Richard T. Lee byly částečně podporovány NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
