TEXT

Ošetření pro meticilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) byla komplikovaná tím, že zvyšuje sazby antibiotické rezistence. MRSA kmeny express penicilin vázající protein 2a (PBP2a), kódovaný genem mecA, který zajišťuje odolnost vůči β-laktamy tím, že chrání reaktivního serinu v úzkých, nepřístupných rozštěp, který umožňuje syntézu buněčné stěny, aby i nadále v přítomnosti antibiotik (1, 2). Ceftobiprol a ceftarolin jsou cefalosporiny proti MRSA, které inhibují PBP2a v terapeuticky užitečných koncentracích. R2 skupiny ceftobiprole zasahuje do úzké štěrbiny PBP2a pro přístup k aktivním místě, vzhledem k tomu, že ceftarolin-vazba způsobuje alosterický změnit v PBP2a, odhalující aktivní místo pro vazbu tím, že druhá molekula (3, 4). Ceftobiprol byl hodnocen v klinických studiích a ceftarolin je schválen FDA pro léčbu infekcí kůže a struktury kůže, včetně infekcí způsobených MRSA (5-10).

Předchozí studie naší skupiny ukázaly, že průjezd COL napětí v ceftobiprole vybere pro rezistentní mutanty s mutací v PBP2a (11). Tato studie zkoumá, zda ceftarolinový průchod také vybírá pro podobné mutace. Chodby byly provedeny experimenty s dvěma různými MRSA pozadí: KOL, archaické homogenně rezistentní izolovat od roku 1961, a SF8300, nestejnoměrně odolných moderní USA300 MRSA kmen. COLnex a SF8300ex, mecA-negativní derivát kmeny COLn a SF8300, byly získány (12) mýtit chromozomální stafylokokové chromozomové kazety mec (SCCmec) (13). Meca divokého typu byla znovu zavedena na plazmid pYK20 (odvozený od plasmidu pAW8 a obsahující Meca divokého typu klonovaný z COL) do COLnex a SF8300ex pro studie průchodu. Pokud mecA bylo zprostředkování odpor, pak buď vytvrzení odolný mutant plasmidu nebo zavedením do vnímavých pozadí by měla za následek ztrátu nebo zisk fenotyp, respektive, což umožňuje stanovení příspěvku mecA na odpor. Kmeny a plazmidy použité v této studii jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. COLnex(pYK20) a SF8300ex(pYK20) byly sériově pasážovány v tryptic soy broth obsahující zvyšující se koncentrace ceftarolin (Forest Laboratories) jak bylo popsáno dříve (11).

Po 28 dnech, COLnex(pYK20) a SF8300ex(pYK20) pasážovány v ceftarolin-přinesly dva mutanty, COLnexpT(pYK20COLT*) a SF8300expT(pYK208300T*) (hvězdička označuje plasmid generované během ceftobiprole nebo ceftarolin-výběr v KOL nebo SF8300 pozadí) (Tabulka 1). Mic na ceftarolin, ceftobiprol a další β-laktamy (Sigma-Aldrich) byly stanoveny metodou ředění vývaru podle standardů CLSI (Tabulka 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) vykazoval vysokou rezistenci jak na ceftarolin, tak na ceftobiprol, s Mic 64 µg / ml a 32 µg / ml. SF8300expT(pYK208300T*) vyjádřil low-level odpor průchodu den 4, s MIKROFONEM, 4 µg/ml, která zůstala beze změny i přes 24 více průchody (Tabulka 3 a Obr. 1). Dříve popsaných ceftobiprole-pasážovány mutant z COLnex(pYK20) (11), COLnexpB(pYK20COLB*), ukázal vysokou úroveň rezistence vůči oběma ceftobiprole a ceftarolin, s MIKROFONEM z 64 µg/ml na každý.

Plasmid mecA byl sekvenován na mutace v pasážovaných kmenech. Protože PBP jsou cílem β-laktamů, byly také sekvenovány pbp1, -2, -3 a -4. Nakonec byly sekvenovány gdpP a acrB, protože mutace v těchto genech byly identifikovány v mecA-negativním ceftobiprolově rezistentním mutantu COL (16). Plasmid pYK208300T* (pYK20 z SF8300ex pasážovány v ceftarolin), má jediný bod mutace (G k v kódování sekvence pozici 1339) v mecA, což má za následek nonsynonymous aminokyselin změnit, E447K. Žádné mutace byly přítomny v jiných PBP geny, acrB, nebo gdpP (Tabulka 4).

Plasmidu pYK20COLT* (pYK20 z COLnex pasážovány v ceftarolin -) neměl žádné mutace v mecA. Bodová mutace (C na T na CD pozici 1327) představujeme H443Y mutace v GdpP, bodovou mutaci (G na na CD pozici 466) představujeme D156N mutace do PBP2, a dvě bodové mutace (A až G na CD pozici 601 a C G na CD pozici 723) zavedení T201A a F241L mutace do PBP4 bylo zjištěno (Tabulka 4). Poznámky, ceftarolin-průchod KOL obsahující mecA v jeho přirozené umístění chromozomální také za následek mutantní s vysokou úrovní rezistence, ale chybí mutace v mecA (údaje nejsou uvedeny). Sekvenční analýza, která pasážovány mutantů odhalila bodové mutace v pbp2 (G na na CD pozici 1891), což má za následek aminokyselinovou změnu G631S, a jeden v pbp4 (T, aby To na CD pozici 414), zavedení N138K mutace. Tyto údaje naznačují, že i v přítomnosti mecA může ceftarolin zvolit mutace v jiných genech, což vede k rezistenci.

Vytvrzování COLnexpB(pYK20COLB*) a SF8300expT(pYK208300T*) svých plazmidů, z nichž každý měl mecA mutace, snížená Mikrofony pro všechny β-laktamy testovány (Tabulky 5 a 6). Vytvrzování přípravku COLnexpT (pYK20COLT*) jeho plazmidu, který postrádal mutace mecA, nemělo žádný účinek na Mic (Tabulka 5). Transformace pYK20COLB*, který obsahuje 6 substituční mutace v mecA, do vnímavých COLnex rodič, získávání transformant COLnex(pYK20COLB*), mělo za následek vysoké úrovni ceftarolin a ceftobiprole odpor. Transformace pYK208300T*, který obsahuje jeden mutace E447K mecA, do COLnex, získávání transformant COLnex(pYK208300T*), mělo za následek vysoké úrovni odolnost vůči ceftobiprole (MIC z 64 µg/ml), ale pouze low-level odpor na ceftarolin (MIC 4 µg/ml) (Tabulka 5). Transformace pYK20COLB* do SF8300ex, získávání transformant SF8300ex(pYK20COLB*), mělo za následek vysokou úroveň rezistence na ceftarolin a ceftobiprole (MIC 32 µg/ml každého) (Tabulka 6). Několik pokusů o transformaci SF8300ex s pYK208300T* bylo neúspěšných.

Jediné aminokyseliny změnit na E447 mecA se zdá, že hraje klíčovou roli v odporu. Je přítomen v ceftobiprole-pasážovány KOL (mimo jiné mutace) (11), to je jediný mecA mutace v ceftarolin-pasážovány SF8300, a to bylo hlášeno v klinických izolátů (17, 18). Strukturálně e447 sídlí v doméně pbp2a vázající penicilin a interaguje se skupinou R2 ceftobiprolu a dalších β-laktamů (3, 19). E447K udělil vysokou rezistenci na ceftobiprol a nízkou rezistenci na ceftarolin v pozadí COLnex, pravděpodobně kvůli strukturálním rozdílům mezi oběma sloučeninami. Mnohočetné mutace v mecA poskytují rezistenci na vysoké úrovni vůči oběma antibiotikům (20). Genetické pozadí také hraje roli. Heterogenní SF8300 pasážovány v ceftarolin vyvinutý low-level odolnost vůči ceftobiprole a ceftarolin s E447K (MIC 4 µg/ml). Tato mutace byla spojena s nízkou hladinou rezistence na ceftarolin v klinických izolátech (17).

Na závěr průchod v obou ceftarolinu nebo ceftobiprole vybere pro E447K mutace v PBP2a, mutace nalezena v ceftarolin-rezistentních klinických izolátů, což podtrhuje jeho význam ve zprostředkování odpor fenotyp (17, 18). I když celý-sekvenování genomu byla provedena, což je omezení této studie, jiné geny než mecA hrát roli, protože úroveň odporu se lišila mezi COL a SF8300 pozadí po zavedení E447K mutace a vysoce odolné pasážovány KOL mutant neměl mecA mutace. I když je pravděpodobné, že ostatní, mutace v genech kódující PBP4 a GdpP se zdají být zvláště důležité, protože tyto byly opakovaně identifikovány v ceftobiprole – a ceftarolin-pasážovány mutanti. Úloha těchto genů a dalších je předmětem aktivního zkoumání.