Výsledky a Diskuse

V těle savců, Cdc42 činnosti bylo prokázáno, že být důležité v regulaci kůže kmenových/progenitorových buněk diferenciace do vlasového folikulu buňky, ovládání neuroepithelial stem/progenitor polarity a mozkové polokoule vidlice a regulaci počtu buněk a růst v perinatálním období vývoje (6-9). Zajímavé je, že vyšetření Cdc42 činnost ve WT dospělých myší, různých věkových kategorií ukazuje, že relativní Cdc42-GTP úrovni starších zvířat je výrazně vyšší než u mladší v různých tkáních, včetně srdce, mozku, plic, jater, kostní dřeně, sleziny a ledvin (Obr. 1 A a údaje nejsou zobrazeny), což zvyšuje možnost, že zvýšená aktivita Cdc42 je zapojena do normálního procesu stárnutí.

určit, zda zvýšené Cdc42 aktivity spojené s přirozeným stárnutím může mít fyziologický význam, jsme zkoumali Cdc42 negativní regulátor, Cdc42GAP, v gene-cílené myši poté, co dosáhli dospělosti. Předchozí studie homozygotní Cdc42GAP knockout myší v perinatálním období je uvedeno, že různé tkáně/buňky obsažené zvýšené Cdc42-GTP, a embrya/novorozených mláďat z Cdc42GAP −/− genotypu zobrazí snížena varhany/organismal velikosti, které jsou spojené se zvýšenou spontánní apoptózu různých typů buněk (6). U dospělých Cdc42GAP−/− myší, Cdc42 aktivita byla constitutively vyšší ve více tkáňové/buněčné typy než odpovídající WT myši, vzhledem k tomu, že úroveň RhoA-GTP nebo Rac1-GTP zůstala podobná WT (Obr. 1 B; údaje nejsou zobrazeny), což naznačuje specifický zisk aktivity Cdc42 u dospělých zvířat podobný aktivitě během perinatálního období. Většina myší Cdc42GAP – / – zemřela během novorozeneckého období kvůli jejich menší velikosti a slabé postavě (6). Část z nich (≈7%) by však mohla přežít novorozenecké období v pěstounské péči nepříbuznými pečujícími ženami. I přes pravidelný příjem mléka a normální sérové glukózy a inzulínu koncentrace se nacházejí v homozygotní myši v postnatálním období , přírůstek hmotnosti Cdc42GAP−/− myší se začal zpomalovat v ≈3 měsíců věku ve srovnání s ≈5 měsíců věku pro WT nebo heterozygotní myši, a zralé homozygotů byly ≈30% snížení tělesné hmotnosti v důsledku snížení celkové buněčnosti (Obr. 1 C a údaje nejsou zobrazeny). Střední životnost Cdc42GAP −/− myší byla ≈12 měsíců, vzhledem k tomu, kontrolních (WT nebo heterozygotní) myši zůstaly životně důležité, dokud medián věku ≈27 měsíců (Obr. 1 D). Křivky přežití v homozygotní myši je poněkud odlišná od typické Gompertz křivky, ale je podobné těm, které uvádí pro BubR1 (mitotický kontrolní bod regulátor), knockout (10) nebo p44 (krátká izoforma p53 tumor supresorový) transgenní (11) zvířata. Kyfóza a nedostatek síly u myší Cdc42GAP – / – se projevily ve věku ≈12 měsíců (obr. 1 E). Kůže Cdc42GAP−/− myší na 15 měsíců věku ukázaly jasné snížení tělesné hmotnosti, značné ztrátě podkožní tukové tkáně, závažné lordokyphosis, a svalová atrofie (údaje nejsou uvedeny). Rentgenové vyšetření ukázalo významný fenotyp kyfózy a sníženou kostní minerální hustotu (BMD) u myší Cdc42GAP−/− ve věku 15 měsíců (obr. 1 F). Další kvantifikace členitých kostí myší Cdc42GAP – / – odhalila 3-a 2, 6-násobné snížení BMD v holenní kosti a stehenní kosti (SI obr. 7). Kromě toho jak samci, tak samice Cdc42GAP−/− myši ztratily plodnost v dřívějším věku ve srovnání s WT. Při páření mezi ženami Cdc42GAP−/− a muži WT se homozygoti stali neplodnými ve věku 26 týdnů ve srovnání se 48 týdny pro WT(obr. 1 G). Tato pozorování naznačují, že Cdc42GAP nedostatek výsledků v constitutively zvýšené Cdc42-GTP úrovni, snižuje velikost těla, brzy kyfóza, snížená BMD, zkrácené období plodnosti, a snižuje životnost u dospělých myší.

H&E obarvené řezy přes 8-měsíc-staré samice myši obratlového těla ukázal, že Cdc42GAP −/− myši měly tenčí, uklonil kůry a tenčí trabekuly v porovnání s WT myší (Obr. 2 A). Podobně délky stehenní kosti homozygotních myší vykazovaly snížení tloušťky kortikální kosti ve srovnání s tloušťkou WT myší (údaje nejsou zobrazeny). Tato pozorování jsou v souladu s hrubým vzhledem a klinickými rysy osteoporózy. Slezina, játra a ledviny dospělých Cdc42GAP−/− myší došlo ke snížení hmotnosti v důsledku snížení celkové buněčnosti, což bylo patrné v H&E-potřísněné části sleziny, a T a B buněk, obsahující bílé dužiny regionech 12-měsíc-starý Cdc42GAP−/− slezina byla výrazně snížena ve srovnání s věkově odpovídajícími WT myší (Obr. 2 B a údaje nejsou zobrazeny), což naznačuje výraznou lymfoidní atrofii u homozygotů. V souladu s zjevné snížení podkožní tuková tkáň, histologický rozbor průřezu z hřbetní kůže odhalila téměř úplná absence s.c. tukové buňky v 9-měsíc-staré Cdc42GAP −/− myší (Obr. 2 C). Ztráta svalové hmoty a svalové atrofie byly také potvrzeny vyšetření H&E-barevného kosterního svalstva oddíly od 12-měsíc-starý Cdc42GAP−/− myší a věk-uzavřeno WT myší (Obr. 2 C). Myši Cdc42GAP – / – také vykazovaly výrazné snížení regenerace vlasů po odstranění hřbetních vlasů holením, zatímco věk a pohlaví odpovídající WT vykazovaly robustní opětovný růst vlasů (SI obr. 8). Schopnost tolerovat stresy, jako je hojení ran, aktivita spojená se stárnutím (12) myší Cdc42GAP−/−, byla významně snížena ve srovnání s aktivitou WT (obr. 2 D). Histopatologická analýza řezů rány ukázala malou reepitelizaci na okraji rány myší Cdc42GAP -/ -, zatímco úplná reepitelizace myší WT byla patrná 4 dny po zavedení rány(obr. 2 E). Kromě těchto pozorování, počet krvetvorných fenotypy homozygotní myši, včetně anémie, snížená sleziny a kostní dřeně cellularities, poruchy hematopoetických kmenových buněk transplantace kostní dřeně a zvýšená citlivost krvetvorných kmenových buněk vyvolaná mobilizace (13, 14) jsou v souladu s počátkem stárnutí v hematopoetického systému. Důležité je, že vyšetření mladých homozygotních myší (<4 měsíce) před projevem zjevných fenotypů neodhalilo žádné závažné abnormality v kostech, kůži a slezině (SI Obr. 9 A A B a údaje nejsou zobrazeny), což naznačuje, že fenotypy podobné stárnutí Cdc42GAP – / – myší nejsou způsobeny časnou vývojovou poruchou. Navíc, řada fenotypy homozygotní myši, včetně snížení kortikální kosti tloušťka, kyfóza, a ztrátu svalové hmoty a epidermální tkáně, lze nalézt ve starých (>2,5 let) WT myší (SI Obr. 9 C A D a údaje nejsou zobrazeny). Jak je shrnuto v tabulce SI 1, souhrnně tyto výsledky poskytují silný důkaz, že nedostatek Cdc42GAP způsobuje u zvířat předčasné fenotypy podobné stárnutí.

Barvení tkání 9-měsíc-staré dospělé, včetně jater, ledvin a sleziny, pro senescence-associated β-galaktosidázy (SA-β-gal) ukázal silnou aktivitu tohoto markeru senescence v homozygotní myši, že není detekovatelný ve tkáních věku a pohlaví-uzavřeno WT myší (Obr. 3 A a SI Obr. 10), což naznačuje, že Cdc42GAP – / – dospělé tkáně mohou podstoupit předčasné stárnutí. Je zajímavé, že zvýšená apoptóza homozygotních tkání pozorovaná během perinatálního období u dospělých homozygotů chyběla, když byla patrná zvýšená aktivita SA-β-gal (ref . 6 a údaje nejsou zobrazeny). Cdc42GAP−/− myších embryonálních fibroblastů (MEF) buňky, které obsahují ≈3-krát vyšší Cdc42-GTP ale normální Rac1-GTP nebo RhoA-GTP obsah ve srovnání s WT MEF buněk (6), vykazoval výrazně zvýšil SA-β-gal aktivity a nahromaděné zploštělé a rozšířené stárnoucí morfologie začátku při průchodu 6, když WT MEF buňky byly negativní na SA-β-gal činnost a jsou smluvní v morfologii (Obr. 3 B A SI Obr. 11). Buňky Cdc42GAP – / – MEF začaly zpomalovat růst v pasážích 5-7, když odpovídající buňky WT MEF rostly exponenciálně (obr. 3 C) (6) a po průchodu 7 podstoupily masivní replikativní senescenci, zatímco většina buněk WT MEF nedosáhla senescence až do průchodu 13 (SI obr. 11 a údaje nejsou zobrazeny). Kromě toho významně vyšší procento buněk Cdc42GAP -− – MEF při průchodu 7 vytvořilo větší ložiska v jádru než buňky WT (SI obr. 12). Tyto výsledky naznačují, že nedostatek Cdc42GAP indukuje časné stárnutí tkáně / buněk.

jedním dobře známým faktorem přispívajícím k předčasnému stárnutí savců a stárnutí buněk je zvýšená genomická nestabilita (15). Metafáze šíření analýza ukázala, že >30% primární splenocytes od 8-měsíc-staré homozygotní myši byly aneuploidní, vzhledem k tomu, věku a pohlaví-uzavřeno WT splenocytes neměla žádné zjistitelné aneuploidie (Obr. 3 D), což naznačuje, že tkáň Cdc42GAP – / – trpěla genomickou nestabilitou. Na podporu tohoto zjištění vykázaly buňky Cdc42GAP−/− MEF významné zvýšení dvojjaderných buněk pod barvením DAPI ve srovnání s buňkami WT při průchodu 7 (SI obr. 12). Karyotyp analýza později pasáže MEF buněk (průchod 6-7) dále ukázal, že, ačkoli většina chromozomů z WT buněk (≈80%) zůstal neporušený, 42% Cdc42GAP−/− buněk obsahovala alespoň jeden chromozomové aberace, 20% obsahoval dvě nebo více podmínek, a 14%, obsahují tři nebo více aberací (Obr. 3 E). Procento a stupeň aneuploidie také výrazně zvýšil v Cdc42GAP−/− MEF buněk, >32% buněk zobrazení abnormální chromozom čísla v rozmezí od 72-102, vzhledem k tomu, že většina WT buňky jsou diploidní (Obr. 3 E A SI Obr. 13). Karyotyp analýza chromozomální škody uvádí, že aberace v homozygotní MEF buňky byly různorodé, včetně chromatid přerušení, předčasné sestra chromatid oddělení (charakteristickým znakem vadného spindle assembly checkpoint), translokaci chromozomů, dicentric chromozomu a chromozomu fragmentaci (Obr. 3 F A SI Tabulka 2), což naznačuje, že zařízení pro opravu poškození DNA je ohroženo v buňkách Cdc42GAP -/ -. Imunofluorescenční barvení fosfo-H2 AX v jádru buňky, DNA, reakce na poškození značky (16), ukazuje, že i když 10% průchod 7 Cdc42GAP−/− MEF buňky byly pozitivní na poškození DNA marker, <1% WT buňky byly pozitivní (Obr. 3 G). Korelace mezi nástupem a progresi stárnutí-jako fenotypy Cdc42GAP−/− myší a pozorované míry a závažnosti genomové aberace v Cdc42GAP −/− buněk, podporuje roli Cdc42 v rozvoji progeroid funkce.

určit možný mechanismus nahromaděné DNA škody v Cdc42GAP−/− buněk, jsme ve srovnání endogenních reaktivních forem kyslíku (ROS) úroveň homozygotní buňky s WT buňkami, protože Rac1 a Rac2, dva úzce související Rho GTPases, jsou známé regulátory buněčných ROS (17). SI Obr. 14 ukazuje, že Cdc42GAP – / – buňky vykazovaly aktivitu ROS podobnou aktivitě WT buněk, což naznačuje, že Cdc42GAP reguluje genomickou stabilitu prostřednictvím endogenního mechanismu nezávislého na ROS. Kvůli podobnosti více Cdc42GAP−/− myši fenotypy těm množství genových cílené myších modelech opravy poškození DNA molekuly, včetně Brca1−/−p53+/−, Ku80−/−, a Mtr−/−Wrn myši modelů (12, 18, 19), jsme dále zkoumali reakce z počátku pasážovány Cdc42GAP−/− buněk na různé DNA poškození látky. V testu růstu odpovědi na poškození DNA vykazovaly buňky s deficitem Cdc42GAP široký defekt aktivity opravy poškození DNA (obr. 4), což se projevuje jako výrazně vyšší procento buněčné smrti mezi homozygotní buňky ve srovnání s WT buněk po ošetření zvýšením dávky H H2O2, ionizující záření, camptothecin, methyl-metan sulfonát, nebo mitomycin C. to Znamená, že nahromaděné různorodé genomické abnormality zjištěné v pozdějších pasážích Cdc42GAP−/− buněk může souviset, alespoň v části, ke zhoršení poškození DNA opravit činnosti.

důsledkem trvalého genomického poškození v buňkách je indukce vícenásobné odpovědi na poškození DNA a / nebo senescence genů (20, 21). Výrazy p53, p21Cip1, p16Ink4a, a fosfo-p53 (Ser-15) v Cdc42GAP−/− MEF buňky byly výrazně vyšší než u WT MEF buněk po podobné pasáže, vzhledem k tomu, že p19ARF v homozygotní buňky vykazovaly podobný trend růstu s pasáží, stejně jako WT buněk (Obr. 5 A). Na hladiny proteinů p53, p21Cip1, p16Ink4a, fosfo-p53 (Ser-15), a poškození DNA marker fosfo-H2 AX v Cdc42GAP−/− tkání od 8-měsíc-staré myši byly také výrazně vyšší než v odpovídajících tkání uzavřeno WT myší (Obr. 5 B). Tyto výsledky poskytují důkazy, že aktivace p53-regulovaných cesta, p21Cip1 a p16Ink4a zejména, je spojena s Cdc42GAP-nedostatek-indukované předčasné senescence. Zkoumat otázku, zda zvýšené Cdc42 činnost v Cdc42GAP-deficientních buněk je dostatečné k účtu pro předčasné senescence fenotyp, jsme vyjádřili aktivace mutantu Cdc42, Cdc42F28L, v primárních WT MEF buněk a testovány pro SA-β-gal aktivitu buněk ve srovnání s odpovídající EGFP-exprimujících buněk v různých pasážích. Cdc42F28L výraz způsobilo významný nárůst v SA-β-gal-pozitivní buněčné populace (35% v Cdc42F28L buněk ve srovnání se 7% v EGFP-vyjádření buňky) na začátku pasážovány MEF buněk (Obr. 5 C), což naznačuje, že aktivace Cdc42 je dostatečná pro indukci časného stárnutí buněk.

dále prozkoumat možnost, že senescence fenotyp Cdc42GAP−/− buněk by mohl být zachráněn p53 vadu, jsme vytvořili Cdc42GAP+/−a p53+/− myší a pokusil se připravit MEF buněk z křížence. Ze 44 embryí bylo získáno šest s genotypem Cdc42GAP – / – p53+ / – a žádný z genotypů Cdc42GAP – / – p53 -/ -. Na Cdc42GAP−/−p53+/− MEF buňky rostly tempem mezi p53+/− a WT buňky a ukázal bazální stárnoucí populace srovnatelná s p53+/− a WT buňky při průchodu 7, vzhledem k tomu, p53−/− a Cdc42GAP−/− MEF buněk roztrhl pytel s lineární křivkou a ohyb-zdvojnásobení populace křivky a byly stárnutí-odolný a stárnutí náchylné na podobné pasáže, respektive (Obr. 5 D A E). Tyto výsledky naznačují, že předčasné stárnutí vyvolané aktivací Cdc42 závisí na p53.

omezená životnost buněk a zvířata mohou vyplynout z replikativní senescence v reakci na různých stresů, včetně poškození DNA (22), eroze telomer (23), ROS (24), a/nebo nevhodně aktivovaných onkogenů (25). Na Cdc42GAP−/− myší vykazuje zisk-z-Cdc42-činnost animal model, který napodobuje mitogenní signál-indukované aktivace Cdc42 (6) a umožní posoudit možné účinky aktivace Cdc42 na zvíře a buněčné fyziologie. Prokazujeme, že nedostatek Cdc42GAP způsobuje časný nástup stárnutí v buňkách a předčasné fenotypy podobné stárnutí u zvířete. Zejména, Cdc42GAP gene cílení vyvolává globální zvýšení Cdc42 činnost a podporuje mobilní genomové nestability se sníženou schopnost opravy poškození DNA, což může aktivovat p53 a p16 Ink4a, což vede k předčasné senescence (Obr. 5 F). Dříve bylo zjištěno, že Cdc42 je aktivován v senescentních buňkách, aby moduloval morfologickou úpravu (26). Bylo také navrženo, aby se zapojili v p53-regulovaných buněčných morfologické změny, apoptózy a proliferace (27-29) a v c-Jun N-terminální kinázy-řízené apoptózy (30, 31), události, které byly spojené s buněčné senescence a zvíře stárnutí (32, 33). Naše zjištění, že aktivace Cdc42 je spojena s přirozeným stárnutím a že Cdc42GAP nedostatek způsobuje poškození DNA opravit defekt aby buňky se hromadí genomické abnormality, které vede k předčasnému stárnutí dále naznačují, že funkční souvislost mezi Cdc42 činnosti a savců stárnutí.

bylo prokázáno, že aktivace dráhy p53 nebo narušení genů zapojených do opravy poškození DNA nebo regulace genomové stability indukuje předčasné stárnutí u myší (11, 12, 33, 34). V souladu s předchozími pozorováními, že Cdc42 nemusí být zapojeny v regulaci buněčné aktivity superoxid (17), jsme zjistili, že nahromaděné poškození DNA v Cdc42GAP−/− buněk není spojena s ROS činnost, protože homozygotní buňky nevykazují zvýšené ROS činnosti. Cdc42GAP smazání způsobuje výrazné snížení poškození DNA opravit schopnost v širokém spektru oblastí, včetně odpovědi na DNA cross-linking agent a double-strand break nebo single-strand break induktor, což naznačuje, že dlouhodobé aktivace Cdc42 může tlumit schopnost opravy poškození DNA. Rozmanitost genomového poškození nalezeného v buňkách Cdc42GAP – / – je také v souladu s dopadem globální vady opravy poškození DNA. Důležité otázky, které je třeba řešit, zahrnují, jaké specifické molekulární determinanty jsou zapojeny do opravy poškození DNA regulované Cdc42GAP a jaký signál(y) proti proudu způsobuje zvýšené Cdc42-GTP během normálního procesu stárnutí.