Výsledky

Charakteristika Plasmacytoid Dendritic Buňky tenkého Střeva.

použili jsme standardní postupy pro izolaci imunitních buněk umístěných v epitelu (intraepiteliální, IE) a LP ze střeva. V obou buněčných preparátech jsme našli zřetelnou populaci buněk CD11c+B220+Ly6C+, která tvořila až 1% všech buněk. Na rozdíl od pDC byly myeloidní (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) přítomny pouze ve velmi nízkých počtech v přípravku IE (obr. 1 A). Jak pDC přípravku LP, tak IE vykazovaly nízké hladiny povrchové exprese MHC třídy II (obr. 1 A). Další analýza ukázala, že CD11c+B220+Ly6C+ buňky obou preparátů rovnoměrně exprimují PDC markery PDCA1 i 120G8 (obr. 1 B). Cytospinech z řazeny pDC (CD11c+B220+Ly6C+) a myeloidní DC (mDC), TJ. příprava odhalila kulaté a hladké, plazmatické buňky-jako morfologie pDC, vzhledem k tomu, že mDC ukázal charakteristické dendrity (Obr. 1 C). Pro další charakterizaci lokalizace pDC ve střevě jsme aplikovali anti-B220, anti-120G8 a anti-CD3 mAb v imunohistologii. Mikrografy byly náhodně odebrány ze sekcí a, jak je znázorněno na obr. 1 D, umístění 120G8+B220+CD3-buněk bylo stanoveno vzhledem k epiteliálním buňkám pomocí analýzy obrazu (analýza; Olympus, Hamburk, Německo). Při hodnocení polohy ≈150 pDC jsme pozorovali, že 4,9% těchto buněk bylo jasně umístěno ve vrstvě epiteliálních buněk, zatímco dalších 6,7% bylo umístěno ve vzdálenosti 5-10 µm od apikální špičky epiteliálních buněk (obr. 1 D). Tyto údaje ukazují, že určité množství pDC najít uvnitř nebo v blízkosti střevní epitel, vzhledem k tomu >80% analyzovaných buněk byly umístěny ve vzdálenostech >15 µm, což je činí jako LP buňky (Obr. 1 D). Protože podobné počty pDC byly přítomny v přípravku IE a LP po standardních izolačních postupech, v současné době není jasné, zda pDC LP kontaminuje přípravek IE nebo zda je umístění pDC do epitelu účinněji izolováno. Protože v přípravě IE sotva najdeme mDC, upřednostňujeme druhou možnost. Zbývá však určit, zda obě populace slouží různým funkcím nebo patří do společné buněčné populace. Protože pDC přípravku IE, na rozdíl od pDC přípravku LP, lze izolovat poměrně jemnými postupy, v této studii byly pro funkční testy použity výhradně pDC přípravku IE.

Ccr9 exprese na střevní pDC.

identifikovat molekulární mechanismy, které umožňují migraci pDC střeva, analyzovali jsme expresi naváděcí molekuly. I když je dobře prokázáno, že integrin AE (CD103) zprostředkovává adhezi lymfocytů k epiteliálním buňkám ve střevě, nepodařilo se nám identifikovat expresi tohoto integrinu na střevním pDC. Podobně CCR7 (obr. 1 E), který se v podstatě podílí na navádění lymfocytů do periferních lymfoidních orgánů, není exprimován pDC střeva. V kontrastu, jsme pozorovali vysokou úrovní CD18 (β2-integrin) a střední hladiny α4β7 vzhledem k tomu ≈50% pDC express P-selektinu ligandy (Obr. 1 E). Zájmu, drtivá většina střevní pDC vyjádřil vysoké částky chemokinový receptor CCR9 (Obr. 1 E), zatímco mDC LP vyjádřilo ne nebo nízké hladiny CCR9 .

Ccr9 exprese pDC izolované z různých lymfoidních orgánů.

Vzhledem k tomu, jednotné vyjádření CCR9 na střevní pDC, analyzovali jsme expresi CCR9 na pDC izolované ze sekundárních lymfoidních orgánů včetně sleziny, kůže-vypouštění LN, mezenterické LN, a peyerových plátů (PP; Obr. 2) a používá CD4+CD8+ thymocytů, známý vyjádřit vysoké úrovně CCR9, jako pozitivní kontrola (11); Obr. 2 B). Je zajímavé, že pouze zlomek pDC přítomný v kterémkoli z těchto orgánů vyjádřil CCR9 (obr. 2 A), zatímco ≈95% pDC izolovaných z BM neslo tento receptor (obr. 2 C). Většina BM pDC také exprimuje CCR5 a CXCR3, zatímco CCR2 je přítomen pouze na zhruba 25% buněk. CXCR4, o kterém je známo, že zadržuje buňky BM, je exprimován pouze velmi slabě (obr. 2 C). Společně tyto údaje ukazují, že pDC jsou vybaveny různými chemokinovými receptory před uvolněním z BM. Tato funkce pravděpodobně umožňuje navádění nejen na místa zánětu, ale také na neinflamované střevo.

Chemotaxická analýza flt3l-expandovaného pDC.

na Základě silný výraz CCR9 na BM a střevní pDC, jsme ve srovnání migrace kapacita pDC a mDC k chemokinový CCL25/TECK, což je jediný známý ligand pro tento receptor (12). Frekvence pDC se liší mezi různými kmeny myší a je dobře známo, že například myši C57BL / 6 (B6) mají mnohem méně pDC než myši 129SV (13). Bez ohledu na genetické pozadí však počet pDC, který lze izolovat z myších tkání, nestačí k provádění standardních testů chemotaxe in vitro. K překonání tohoto omezení jsme rozšířili populaci DC in vivo implantací nádorové buněčné linie vylučující Flt3-L (B16-FL) u myší B6 po dobu 14 dnů (14).

během tohoto časového období se procento buněk CD11c+ přítomných ve slezině zvýšilo z 3% na 30-35% (údaje nejsou zobrazeny). Osmdesát procent in vivo rozšířeného pDC vyjádřilo CCR9, s úrovněmi velmi podobnými hodnotám přítomným na BM pDC(obr. 2 C a obr. 4 C) zatímco in vivo expandovaný mDC exprimoval pouze malá množství tohoto receptoru (SI obr. 6B). Slezina pDC byly obohaceny o CD11c+ MACS-třídění, což v 95% čistotě pro CD11c+ buňky, které jsou obsaženy ≈15% Ly6C+B220+ pDC. In vitro transwell migrační testy odhalily silné chemotaktické odpovědi pDC, aby CCL25, stejně jako CXCL9, ligand pro CXCR3 a CXCL12, který je ligandem pro CXCR4. Pouze slabá odpověď byla pozorována vůči CCL19, který slouží jako ligand pro CCR7. mDC vykazovala malou chemotaktickou odpověď vůči CCL25 a CXCL9 a mírnou odpověď vůči CXCL12 a CCL19 (obr. 3 A).

snížený počet pDC v tenkém střevě myší s deficitem CCR9.

Na základě těchto pozorování jsme charakterizovali distribuci pDC u myší s deficitem CCR9. Zjistili jsme podobná procenta pDC v plicích a játrech (SI obr. 7) stejně jako v inguinálních a mezenterických lymfatických uzlinách, zatímco počet splenických pDC byl mírně zvýšen u myší ccr9−/ -. Naproti tomu jsme pozorovali >90% pokles střeva a 50% snížení PP pDC (obr. 3 B).

pDC přednostně migruje do tenkého střeva.

Na základě dosud popsaných zjištění se zdálo pravděpodobné, že pDC vyžaduje CCR9 pro navádění do tenkého střeva. Abychom tuto hypotézu dokázali, adoptivně jsme přenesli buňky z dárců B6 a CCR9−/−, kteří nesli nádor vylučující Flt3-L po dobu 14 dnů. Pod vlivem Flt3L pDC expandoval v podobném rozsahu u myší B6 a CCR9−/− (obr. 4 A A SI Obr. 8) a byly nerozeznatelné, pokud jde o expresi CCR2, CCR5 a CXCR3, zatímco CCR9 byl detekován pouze na pDC odvozeném od dárců s deficitem B6, ale ne CCR9 (obr. 4 C). Bez dalšího čištění, splenocytes těchto dárců byly označeny 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE) a 5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester (TAMRA). Směs buněk s deficitem WT A CCR9, upravená tak, aby obsahovala stejný počet pDC, byla i.v. přenesena do příjemců B6. Po 18 h převodu, jsme nejprve analyzovali složení adoptively převedeny WT buněk přítomných v IE, stejně jako LP příprava a všiml si, že 54% a 25% všech buněk získaných z IE a LP zlomek respektive byly pDC (Obr. 4 B). Tato zjištění ukazují, že mezi různými buněčnými populacemi se pDC domů přenáší nejúčinněji do střeva. Tyto konkurenční převody také ukázal, že CCR9-nedostatečné pDC jsou do značné míry narušena jejich schopnost se domů do střeva, což se odráží v nízké migrační poměr CCR9-deficitní vs. WT pDC našel v IE a LP příprava (Obr. 4 D). Naproti tomu ccr9-deficientní a B6 pDC migrovaly s podobnou účinností do periferních a mezenterických lymfatických uzlin (obr. 4 D). Povaha buněčného značení neměla na tyto experimenty žádný dopad, protože výměna barviv mezi B6 a ccr9 – / – buňkami přinesla identické výsledky(údaje nejsou zobrazeny). Ačkoli tyto údaje jasně ukazují, že pDC vyžadují CCR9 pro efektivní navádění do střeva, je třeba zmínit, že vlastnosti obchodování pDC z myší léčených Flt3-ligandem se mohou lišit od vlastností přítomných ve fyziologických situacích.

pDC se rekrutují do zaníceného střeva.

Protože je známo, že pDC hrát důležitou roli v anti-virové imunity (4, 10) jsme spekulovali, že pDC mohli být přijati do střeva během zánětlivých procesů pro posílení první linii obrany. Je známo, že toxin cholery (CT) indukuje střevní zánět při perorálním podání a bylo hlášeno, že během 2 hodin po perorální aplikaci se počet mDC přechodně přijatých do střeva zvyšuje 4krát (15). Pozorovali jsme, že kromě mDC se počet pDC také zvýšil 3krát při krmení myší B6 10 µg CT (obr. 4 E). Zájmu, identické experimentální setup nikdy za následek zvýšení pDC ani v IE, ani LP příprava CCR9-deficientních myší po 1, 2, nebo 3 h CT-léčba (Obr. 4 E a údaje nejsou zobrazeny). Konkrétní požadavek na CCR9 na pDC pro jejich nábor do střeva během zánětlivých procesů byla potvrzena adoptivní přenos WT a CCR9-nedostatečné pDC, aby CCR9-nedostatečné příjemců následuje aplikace CT, jak je popsáno výše. Zatímco adopčně přenesené wt pDC byly dostatečně přítomny v přípravku IE a LP, pDC s deficitem CCR9 byly z těchto kompartmentů téměř zcela vyloučeny (obr. 4 F). Společně tyto výsledky ukazují, že během zánětlivých příhod může být pDC rekrutován do střevní sliznice a že tento mechanismus se spoléhá na velké rozšíření na CCR9.

Role střevního pDC pro rychlou mobilizaci LP Myeloidu DC.

To bylo nedávno prokázáno, že perorální aplikace TLR7/8 ligand resiquimod (R848) výsledky v rychlé mobilizaci LP DC a TNFa, případně vydané pDC, je zapojen v tomto procesu (16). Spekulovali jsme tedy, že střevní pDC může být zdrojem TNFa, který potenciálně spouští mobilizaci sousedního mDC. Pro testování této hypotézy jsme in vitro stimulovali B6 pDC přípravku IE a LP po dobu 16 h S R848. Opravdu, pDC vylučuje značné množství TNFa, ale nepřineslo žádné detekovatelné množství IL-2, IL-4, IL-5, nebo IFNy (Obr. 5 A). Poté jsme analyzovali mobilizaci LP mDC in vivo po perorální aplikaci R848. Zatímco neošetřené myši B6 a CCR9−/− se nelišily, pokud jde o přítomnost střevního mDC (obr. 5 B), během 2 h orální R848 indukoval mobilizaci ≈60% mDC u WT, ale pouze 10,8% u ccr9 – / – myší. Důležitější je, jakmile CCR9-deficientní myši.v. obdržel sleziny pDC Flt3L léčených WT dárci 16 h před perorální aplikací R848, tento nedostatek ve střevní mDC mobilizace mohlo být zcela zachráněn (Obr. 5 C). Tyto experimenty ukazují, že navádění pDC do střeva závislé na CCR9 se podílí na rychlé mobilizaci střevního mDC po perorální aplikaci ligandu TLR7/8. Protože bylo prokázáno, že ostatní v krysím modelu, že aplikace LPS také indukuje mobilizaci LP mDC (17), použili jsme 50 µg LPS i.p. na WT a CCR9-nedostatečné zvířata. Zájmu, za těchto experimentálních podmínek se nám nepodařilo pozorovat žádný rozdíl mezi WT a CCR9-nedostatečné zvířat týkající se mobilizace LP mDC (SI Obr. 9).