Diskuse

tato studie odhalila roli pro SR luminální Ca-vázající protein, CSQ2 v regulaci excitace–kontrakce spojení a CICR v centru. Konkrétně, ukazujeme, že nadměrná exprese CSQ2 zprostředkovaná Ad dramaticky zvýšila velikost obou přechodů CA indukovaných ICa a spontánních CA jisker v izolovaných srdečních buňkách. Analýza stoupající fáze a rychlost změny těchto Ca signály uvedlo, že jejich rozšířená velikost byla vzhledem k zpomalilo ukončení hlubších Ca-release tavidla ze SR. Kromě prodlužování aktivního Ca uvolňování, dynamika funkční dobíjení SR Ca obchody byly rovněž zpomalil v buňkách se zvýšenou CSQ2 hladina bílkovin, jak je uvedeno zpomalil čas obnovy pro opakované Ca jiskry. V podstatě jsme získali opačné výsledky v myocytech, ve kterých byly hladiny CSQ2 sníženy ad-zprostředkovanou antisense transdukcí. Tyto myocyty vykazovaly kratší uvolňování Ca, ale urychlily restituci míst uvolňování Ca. Kromě toho v periodicky stimulovaných myocytech se sníženými hladinami CSQ2 způsobila aplikace isoproterenolu arytmogenní oscilace intracelulárního . Tyto výsledky ukazují, že CSQ2 je klíčovým determinantem uvolňující funkce Sr Ca, která působí tak, že řídí dobu uvolňování Ca a refraktornost místa uvolnění. Ve světle pozorovaného isoproterenol závislé poruchy rytmické Ca cyklistika v myocytů underexpressing CSQ2, naše výsledky jsou důležité pro pochopení buněčné mechanismy katecholaminů-indukované arytmie spojeny s mutací CSQ2 gen.

molekulární mechanismy působení CSQ2. Pozorované účinky CSQ2 na uvolňování Sr Ca připisujeme schopnosti tohoto proteinu fungovat jako molekulární pufr, který řídí Volný v luminálním prostoru SR (viz navrhované schéma na obr. 5). Je známo z lipidové dvojvrstvy studie, že vazba Ca na luminálním aspektu RyR komplexní (tj. luminální čidlo Ca) zvyšuje kanálu aktivity, vzhledem k tomu, že na sníží luminální , kanál aktivita je snížena (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Protože mnoho RyRs by být v aktivovaném stavu při normální klidové luminální Ca úrovně (≈1 mM), snižuje luminální během procesu uvolňování by proto snížit celkové kanálu činnost (proces se nazývá luminální Ca-dependentní spolujezdce; ref. 3). Naše výsledky naznačují, že při stabilizaci místní zdarma luminal v blízkosti RyRs během procesu uvolňování, CSQ2 zpomaluje luminální Ca-dependentní uzavření RyR kanálů, čímž se zvyšuje množství Ca propuštěn z SR do cytosolu. CSQ2 také řídí dynamiku zotavení volného intra-SR během zpětného vychytávání Ca tím, že slouží jako dřez pro Ca v lumenu SR. Tak, CSQ2 nejen zesiluje SR Ca efluxní ale také stabilizuje CICR modulací funkční restituce, nebo připravenost, Ca-uvolňování stránek po každém vydání. Nedávno jsme použili podobný mechanismus k vysvětlení účinků chelátorů CA s nízkou afinitou (organické soli) naložených do SR na uvolňování Ca (3). Důležitost našich současných zjištění spočívá v tom, že ukazují, jak je proces uvolňování řízen endogenním, SR-rezidentní Ca-vazebný protein, CSQ2. Odhalují také patologické důsledky sníženého množství CSQ2 v SR srdečních buněk.

bylo navrženo, že CSQ2 může ovlivnit funkci CA-uvolňovacího kanálu prostřednictvím přímých interakcí s proteiny obsahujícími komplex CA-uvolňovacího kanálu (tj. 13; pro přehled viz ref. 9). Naše studie neodhalily žádné významné rozdíly v parametrech uvolňování Sr Ca mezi buňkami obsahujícími přibližně 3krát zvýšené hladiny proteinu CSQ2 a buňkami, ve kterých byly organické pufry vloženy do SR (3). To znamená, že nejjednodušší vysvětlení našich zjištění je, že převládající účinky CSQ2 na SR Ca vydání jsou vzhledem k pufrační akce tohoto proteinu uvnitř SR. Objasnění detailní mechanismus, který CSQ2 a asociovaných proteinů, jako je junctin a triadin regulovat Ca vydání musí počkat studie zahrnující manipulaci hladin a exprese mutantní formy těchto proteinů se změněnou schopností komunikovat mezi sebou a RyR.

maximální rychlost uvolňování Ca ze stimulovaných myocytů byla podobná bez ohledu na množství CSQ2 vyjádřené v SR (obr. 2B a 3D). Tyto výsledky podporují představu, že CSQ2 controls ukončení procesu uvolňování, ale tyto výsledky nejsou to, co by člověk nutně předvídat na základě očekávané pufrační účinky tohoto proteinu v SR. Opravdu, maximální rychlost uvolňování se očekává, že bude vyšší v buňkách se zvýšenou luminální Ca-ukládání do vyrovnávací paměti silných stránek způsobené zpomalil pokles zdarma v rámci SR , protože v těchto buňkách, zpoždění poklesu Ca gradientu v SR membráně by se očekávat, že činí větší Ca tok intenzity. Několik možných důvodů vysvětluje, proč to nebylo pozorováno. Jedna možnost je, že počáteční zdarma v rámci SR může být nižší v CSQ2-expresí než v CSQ2-underexpressing buněk. I když v ustáleném stavu je zdarma v uzavřeném prostoru, jako jsou SR by neměl být ovlivněn počet Ca-vazebná místa (to by mělo pouze vliv kinetiky, při které v ustáleném stavu uvnitř SR je dosaženo), je možné, že pravda ustáleném stavu nebyla dosažena v našich experimentech (např. myocyty prochází nízká míra stimulace). Další možností je, že přítomnost zvýšených hladin proteinu CSQ2 zpomaluje difúzi Ca v luminálním prostoru, čímž zpomaluje exodus Ca otevřenými kanály. Je zřejmé, že k vyřešení tohoto problému je zapotřebí více výzkumu, experimentálního i teoretického.

ukončení CIKR. Jak je cicr, proces s inherentním sklonem k vlastní regeneraci, ukončen, byl předmětem intenzivního výzkumu, nejprve pomocí měření globálních Ca přechodů a v poslední době zkoumáním CA jisker(3, 27-30). Jedna z možností, která byla zvažována, je to, že RyR kanálů podstoupit Ca-závislé inaktivace nebo přizpůsobení v důsledku vzestupu na cytosolové straně kanálu (27-29). Další možností je, že pokles v rámci SR poskytuje aktivní signál pro uzavření RYR po jejich otevření (3, 30-32). Nedávno jsme zjistili, přímé experimentální důkazy pro roli luminální Ca-indukované změny v RyR aktivitu (tj., luminální Ca-dependentní spolujezdce) v ukončení SR Ca uvolnění upnutí hladiny intra-SR s nízkou afinitou Ca vyrovnávací paměti načten do SR cisternae (3). Pomocí těchto vyrovnávacích pamětí, které jsme výrazně prodloužila délka aktivního Ca uvolnění hlubších oba fokální a globální Ca přechodové jevy v myocytů. V souladu s těmito nálezy, naše současné výsledky ukazují, že zvýšení hladiny vysokokapacitní SR luminální Ca vyrovnávací paměti CSQ2 prodlužuje Ca-release trvání, vzhledem k tomu, že snížení množství tohoto endogenního vyrovnávací paměti zkrácené vydání trvání, zřejmě tím, že zpomaluje nebo zrychluje luminální Ca-dependentní uzavření RyRs, resp. Společně tyto výsledky poskytují přesvědčivé důkazy o úloze luminální CA-dependentní deaktivace RyRs při ukončení CICR. I když prokázat důležitost změny v luminální Ca v ukončení SR Ca vydání, naše výsledky nemusí nutně vyloučit možnost, že i další mechanismy, jako je RyR inaktivace nebo přizpůsobení v cytosolu Ca regulační stránek může také ovlivnit, Ca-uvolnění ukončení.

ačkoli existují jasné důkazy o roli změn luminální Ca při ukončení srdečních jisker (ref. 3; současná studie), předchozí studie ukázaly, že Ca jiskry v kosterním svalu nemusí být doprovázeny podstatným vyčerpáním SR . Lacampagne et al. (33) pomocí kinetické analýzy s vysokým časovým rozlišením Ca jiskra nahrávky naznačují, že Ca-uvolnění toku hlubších Ca jiskra je konstantní v obojživelník svalových vláken. Protože tok Sr Ca musí klesat, kdykoli SR klesne, tento výsledek by mohl znamenat, že luminální hladiny Ca zůstanou během jisker Ca stabilní. Existuje tedy možnost, že základní mechanismy odpovědné za ukončení jisker se liší v srdečním a kosterním svalu. Modulace hladin proteinu CSQ ve vláknech kosterního svalstva a rychlé měření kinetiky Ca v srdečních myocytech) by mělo pomoci objasnit tento problém.

Relevance pro CPVT. Jedním z nejdůležitějších aspektů našich výsledků je, že ukazují, jak snížené hladiny CSQ2 mohou způsobit srdeční arytmie na buněčné úrovni. CPVT je arytmogenní onemocnění charakterizované synkopou a náhlou smrtí indukovanou cvičením a infuzí katecholaminu (34). Dosud byly s CPVT spojeny čtyři mutace. Zdá se, že tři z těchto mutací vedou ke snížené expresi CSQ2 (17) a jedna mutace byla navržena tak, aby vedla k narušení vazby Ca (16). Naše výsledky naznačují, že základní příčina CPVT může souviset s abnormální restitucí mechanismu uvolňování Ca způsobeného sníženými hladinami CSQ2 (obr. 5). Vzhledem k nižší koncentraci Ca-vazebných míst v SR buněk podexpresujících CSQ2 dochází k rychlejšímu doplňování CA úložiště pumpou SERCA než v normálních buňkách. Obchod dobíjení se stává ještě rychlejší, když aktivita SERCA je stimulována protein kinázy A, potenciálně představuje závislost klinické epizody CPVT na katecholaminy. V myocytů s snížila CSQ2 úrovně, předčasné obnovy Ca-release programy z luminální Ca-dependentní žáruvzdorné státu vedla k spontánní, extrasystolic vypouštění SR Ca obchody. Je známo, že spontánní uvolňování Ca může indukovat vnitřní proudy a oscilace v membránovém potenciálu, což má za následek spuštěnou arytmii (4-7). Proto, pozorované poruchy v Ca manipulace může vysvětlit, alespoň z části, patogeneze CPVT spojeno s genetických vad, které vyplývají buď snížena Ca-vazebnou aktivitu (16) nebo snížená exprese úrovně CSQ2 (17).

srovnání s předchozími studiemi na transgenních myších. Naše nálezy se liší od předchozích výsledků získaných u transgenních myší s nadměrnou expresí CSQ2 (14, 15). V těchto studiích, 10 – až 20-krát zvýšená exprese CSQ2 zvýšil SR Ca skladovací kapacity izolovaných srdečních myocytů; nicméně, luminální Ca byl k dispozici pro vydání, což vede k depresi globální a lokální Ca-release signály. Tyto změny v manipulaci s Ca byly doprovázeny několika strukturálními, funkčními a biochemickými změnami na buněčné a subcelulární úrovni a rozvojem srdeční hypertrofie a selhání. Na druhou stranu, tato studie udržuje hladiny proteinu CSQ2 blíže fyziologickým hladinám za akutních spíše než chronických stavů; tyto údaje tedy pravděpodobně přesněji odrážejí přímé fyziologické důsledky změn hladin proteinu CSQ2 na intracelulární manipulaci s Ca. Tyto výsledky poukazují na možné problémy při interpretaci účinky konstitutivní vysoké úrovni exprese proteinů v transgenních zvířecích modelů a hodnoty doplňkových studií ve více akutní nastavení.

závěr. Závěrem jsme zjistili, že CSQ2 je základním determinantem schopnosti SR ukládat a uvolňovat Ca v srdečním svalu. Zdá se, že CSQ2 slouží jako rezervoár pro Ca, který je snadno přístupný pro CICR, a také jako aktivní ca pufr, který moduluje lokální luminální CA-dependentní uzavření RyRs. Současně CSQ2 stabilizuje mechanismus CICR zpomalením funkčního dobíjení obchodů Sr Ca. Abnormální odkladné chování kanálů uvolňujících Ca by mohlo představovat nebo přispívat k komorovým arytmiím spojeným s mutacemi v genu CSQ2.