Coxsackievirus B3 (CVB3) je enterovirus z čeledi Picornaviridae. Následující vazba na coxsackievirus and adenovirus receptor (6, 64), virové RNA vstupuje do cytoplazmy, kde je přeložen do jednoho polyproteinu hostitelského translačního stroje. Polyprotein je pak proteolyticky zpracován virovými proteázami za vzniku všech virových strukturních a nestrukturálních proteinů. Virus-kódující RNA-dependentní RNA polymeráza přepisuje negativní-strand virové Rna, které slouží jako šablony pro syntézu více potomstva genomů. Po virovém balení se virus uvolňuje, potenciálně pod vlivem 2B proteinu kódovaného virem (67). Během replikační proces a virové potomstvo vydání, cytopatického efektu (CPE) se vyskytuje a hostitelské buňky je zraněn, s případnou ztrátu životaschopnosti.

během parazitizace pikornaviru se mění více hostitelských buněčných procesů. Virový protein 2Apro přímo štěpí eukaryotický iniciační faktor 4 gama (eIF4G). Štěpení tohoto překladu zahájení faktorem nejen ruší cap-dependentní mRNA překlad (19), produkty štěpení jsou věřil stimulovat překlad neukončené mRNA, jako je noncellular pikornavirus genomu (43), který využívá nové vnitřní ribozomu vstupu mechanismus pro zahájení bílkovin překlad (31, 76). Poliovirus proteiny 2Apro a 3Cprohave prokázáno, štěpit TATA-binding protein, s 3Cpro také vypnutí transkripce RNA polymerázy I, II a III (11, 72, 74). Transkripční faktory TFIIIC (10), CREB (73), a Oct-1 (75) jsou také štěpen 3Cpro během pikornavirus infekce. CVB3 protein 2B bylo prokázáno, upravit endoplazmatického retikula a plazmatické membrány propustnost (14), což způsobuje zvýšení cytosolové zdarma koncentrace vápníku (28, 67) a membrána léze, které mohou usnadnit virové potomstvo vydání. Iontové gradienty se zhroutí (40, 52) a aktivita fosfolipázy se změní (24, 29). CVB3 infekce HeLa buněk vede k tyrosinové fosforylaci dvou buněčných proteinů při 4 h po infekci a inhibice těchto fosforylací významně snižuje produkci virového potomstva (27). Je zřejmé, že infekce je dynamický buněčný proces, při kterém včasné interakce mezi virovými a hostitelskými proteiny určují výsledek jak pro virus, tak pro hostitelské buňky.

nyní je zřejmé, že cysteinové proteázy v rodině kaspázových enzymů jsou klíčovými efektorovými molekulami při apoptotické buněčné smrti. Jakmile je aktivován, caspases štěpit specifické substráty, včetně poly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) (35), DNA fragmentačního faktoru (DFF) (37), gelsolin (34), lamin A (58), sterol regulatory element-binding proteiny (68), α-fodrin (12, 66), fokální adhezní kináza (71), a mdm2 (18), mezi mnoho jiní. Takové štěpné události vedou k důležitým změnám normálních homeostatických buněčných procesů a odpovídajícím morfologicko-strukturálním změnám buněk.

mnoho virů má biochemické mechanismy, které se vyhýbají a / nebo indukují apoptózu v buňkách, ve kterých sídlí (recenze viz odkazy49 a 60). Různé viry interagují v různých stádiích cesty apoptotické smrti. Viry vyvinuly strategie cílení Fas ligand-Fas nebo tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α)–TNF receptor signalizační komplex, Bcl-2 rodiny regulačních orgánů, nebo kaspázy rodiny katů (49, 60). Mechanismy smrti buněk infikovaných CVB3 je třeba určit; existují však omezené morfologické důkazy týkající se indukce apoptózy v buňkách infikovaných pikornavirem. Důkazy získané s Theiler je myší encefalitidy virus (32, 65) a polioviru (63) má uvedeno, že pikornavirus-infikované buňky podstupují apoptózu, na základě morfologických kritérií, včetně jaderné kondenzaci a fragmentaci DNA.

k určení, zda jsou kaspázy aktivovány a odpovědné za CPE pozorované po infekci CVB3, HeLa buňky (American Type Culture Collection, Rockville, Md.) byl buď napaden, při multiplicitě infekce (MOI) 5, s CVB3 (velkoryse poskytl Charles Gauntt, University of Texas Health Sciences Center, San Antonio), nebo podvod zacházeno s minimální esenciální médium (MEM) chybí fetální bovinní sérum (FBS), po dobu 45 min. Buňky byly promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a poté byl substituován kompletní MEM obsahující 10% FBS. Pozitivní apoptózy kontrola se skládala z HeLa buněk ošetřených s fotosenzibilizátor benzoporphyrin derivát monoacid prsten (BPD-MA) po dobu 1 h a poté vystaven na viditelné světlo, jak bylo popsáno dříve (22, 23). Kultury byly zkoumány a sklizeny na 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, a 12 h po infekci. Buňky byly promyty dvakrát ve studené PBS a lyžují v 1 ml lyzačního pufru (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0, 15 U aprotinin / ml) na 75-cm2 oblasti kultury. Po 20minutové inkubaci na ledu byly supernatanty odebrány po centrifugaci při 10 000 ×g a uloženy při -20°C pro další biochemické analýzy.

časový vzorec produkce virových proteinů CVB3, viru potomstva a vývoj degenerativních morfologických změn HeLa buněk byl zvažován ve spojení s vyšetřením proteinů smrti hostitelských buněk. Vzorky buněčných lyzátů byly odděleny elektroforézou dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidového gelu. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu (Hybond ECL nitrocelulózové membrány; Amersham). Membrány byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě v blokujícím pufru (PBS s 0,1% Tween 20 a 5% sušené netučné mléko). Po dvou promytích v mycím pufru (PBS s 0.1% Tween 20), membrány byly inkubovány s protilátkou proti CVB3 (králičí polyklonální anti-CVB3, 1:1,000; Přesné Chemických látek). Membrány byly promyty třikrát v promývacím pufru a inkubovány se sekundární protilátkou proti králičímu imunoglobulinu (Amersham). Membrány byly třikrát promyty, a křenovou peroxidázou konjugované sekundární imunoglobuliny byly detekovány zvýšené metoda chemiluminiscence (ECL, Amersham) a vystaveny Hyperfilm (Amersham) autoradiografie filmu. Významné zvýšení syntézy virových proteinů by mohlo být detekováno mezi 3 a 5 h postinfekcí (obr.1B). Virové proteázy štěpí virové i hostitelské proteiny brzy po infekci. Pomocí immunoblot analýzy s myší monoklonální anti-eIF4G (1:1,000; Transduction Laboratories), bylo zjištěno, že eIF4G je štěpen virové proteázy 2A začátku do 1 h postinfection, s další ztrátou detekce 220-kDa protein o 5 h postinfection (Obr. 1C). Množství CVB3 v buněčném supernatantu (uvolněný virus) bylo stanoveno na monovrstvách HeLa buněk metodou testu agarového překryvu plaku, jak bylo popsáno výše (3). Krátce, vzorek supernatantu byl sériově naředěn 10-krát, ředění byly překryty na 90 až 95% konfluence monovrstvy z HeLa buněk v šest-no destičky (Costar), a obložil buňky byly inkubovány po dobu 1 h (5% CO2, 37°C). Médium obsahující nevázaný virus bylo odstraněno a v každé jamce byl překryt teplý kompletní MEM obsahující 0,75% agaru. Destičky byly inkubovány po 36 až 48 h (5% CO2, 37°C), pevné s Carnoy je fixační (95% ethanol–kyselina octová ), a barevné s 1% krystalové violeti. Potomstvo virus byl přítomen v supernatantní na bazální úrovně mezi 1 a 5 h. O 6 h postinfection tam byl detekovatelný nárůst v supernatantu virus v krvi, a exponenciální virus výroba začala v 9 h postinfection, jak určí zubní plak testy (Obr. 1A). HeLa buňky vykazovaly výrazné změny v morfologii, včetně buněčné kondenzace, zaokrouhlování nahoru, a uvolnit z kultury, jednovrstvé, mezi 6 a 7 h po infekci, jak poznamenal kontrastní mikroskopie (Obr. 1D).

určit, zda hostitel buněčné smrti stroje je aktivován následující CVB3 infekce, immunoblot analýza lyzátu shromažďovány v určitých časových bodech byla provedena. Kaspázy 3, který je přítomen v buňkách jako prekurzor protein s molekulovou hmotností 32 kDa, je primární molekula podílející se na spuštění buněčné smrti. Pomocí myší monoklonální anti-caspase 3 (1:1,000; Transduction Laboratories), bylo zjištěno, že dosud neinfikovaných buněk, obsahuje 32-kDa prekurzor bílkovin. Po infekci CVB3 se hladina prekurzorového proteinu 32-kDa začala snižovat mezi 7 a 8 h postinfekcí a byla téměř úplně nedetekovatelná 12 h postinfekcí (obr.2). K určení, zda ochuzený pro-kaspázy 3 byla proteolytically zpracované z jednoho řetězce zymogen, aby jeho aktivní dva řetězce enzymu, HeLa buněčné lyzáty byly inkubovány s kaspázy 3 fluorescenční substráty jako předchozí popsané (23). Krátce, buněčné lyzáty byly inkubovány s reakčním pufru (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol), obsahující 100 µM kaspázy 3 substrátu acetyl-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-methylkumarin (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) nebo Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluormethylkumarin (z-DEVD-AFC) (produkty enzymových systémů, Livermore, Kalif.). Reakční směs byla inkubována při 37°C po dobu 2 h a fluorescenční excitace AMC nebo AFC při 380 nebo 400 nm byla měřena při 460 nebo 505 nm cytofluorometrem 2350 (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Kanada). Při použití tohoto přístupu byla aktivita kaspázy 3 patrná 5h postinfekcí. Zvýšení aktivity kaspázy 3 ze 7 na 10 h po infekci, když bylo dosaženo maximální úrovně aktivace, bylo udržováno až do 12 h po infekci (obr. 2). Tento test proteázy prokázal, že kaspáza 3 je v aktivní formě v infikovaných buňkách a že je schopna proteolyticky zpracovávat jiné kaspázy a substráty.

Kaspáza 3 štěpí specifické substráty na zbytcích kyseliny asparagové (42). Bylo prokázáno, že PARP, jaderný protein podílející se na opravě DNA (13, 69), je substrátem pro aktivovanou kaspázu 3 a další kaspázy (35). V apoptotických buňkách se PARP štěpí z proteinu 116-kDa, čímž se získá fragmenty 85 a 25 kDa, stanovené protilátkami pro amino a karboxylové terminy proteinu. V CVB3 infikovaných HeLa buněk, PARP rozkladu, s výskytem 85 kDa fragment, byl zjistitelný 9 h postinfection, dále snížení hladiny 116-kDa peptid o 10 a 12 h postinfection, jak je určeno pomocí immunoblot analýzy s myší monoklonální anti-PARP (1:2,000; Biomol) (Obr. 3).

DFF je cytosolický protein, který může být štěpen kaspázou 3 (37). Jakmile se štěpí, tento protein se uvolní endonukleázou, která migruje do jádra, kde může štěpit DNA na internucleosomal míst, což vede k fragmentaci DNA (16). Již dříve bylo prokázáno, že degradace internukleosomální DNA je buněčným rysem infekce pikornavirem (32). Jak je stanoveno pomocí králičí polyklonální anti-DFF (velkoryse poskytla Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), DFF se odštěpí od 45-kDa protein, produkující 30-kDa fragment začátek v 9 h po infekci, s pokračující zpracování a ztráta 45-kDa protein mezi 10 a 12 h postinfection (Obr. 3).

určit, zda caspases přímo produkují charakteristické CPE, která se vyskytuje následující pikornavirus infekce nebo jsou aktivovány po morfologické změny buňky byly ošetřeny s obecným inhibitorem kaspázy benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (ZVAD.fmk). Zásobní roztok (100 mM v dimethylsulfoxidu) ZVAD.fmk (Bachem) byl zředěn v kompletní MEM pro koncentrace v rozmezí od 0 do 200 µM, a roztoky byly inkubovány s buňkami po dobu 30 min před infekcí či léčby světlem. Po infekci CVB3 byly buňky promyty PBS a kompletní MEM obsahující 10% FBS a čerstvý ZVAD.poté byla nahrazena fmk (0 až 200 µM). Bylo prokázáno, že tento peptid inhibuje indukci morfologických změn více apoptotickými podněty (46, 54). ZVAD.fmk v koncentracích 50, 100 a 200 µM zablokoval oba kaspázy aktivitu a štěpení PARP a DFF v BPD-MA – a světlo léčených HeLa buněk (pozitivní kontrola pro apoptózy) (Obr. 4). V buňkách HeLa infikovaných CVB3 bylo štěpení PARP a DFF částečně zabráněno inhibitorem při koncentracích 50 a 100 µM (obr. 4). Při nejvyšší koncentraci inhibitoru (200 µM)nebyl v buňkách léčených CVB3 10 h po infekci prokázán štěpný fragment PARP nebo DFF. Štěpení kaspázy strukturálních proteinů, jako jsou aktin, gelsolin, lamin B, a fokální adheze kináz je zodpovědné za morfologické změny pozorované po indukci apoptózy (42, 45). Po 2 h po fotoaktivaci BPD-MA byly buňky HeLa kondenzovány, měly rozsáhlé membránové blebování a uvolňovaly se z monovrstvy (obr.5). Při zvyšujících se koncentracích ZVAD.fmk, tento apoptotický fenotyp nebyl zřejmý, přičemž buňky si udržovaly morfologii podobnou morfologii kontrolních buněk (obr. 5). CVB3 infikovaných HeLa buněk byly kondenzované a byli uvolnění z jednovrstevné, ale vystavoval č. membrane blebbing v 10 h po infekci (Obr. 5). Blokáda kaspázové aktivity ZVAD.fmk při koncentracích do 200 µM nezměnila cytopatický fenotyp, přestože štěpení substrátů (DFF a PARP) bylo inhibováno.

klasickým rysem virů z čeledi Picornaviridae je buněčný CPE po infekci. Od objevu techniky extraneurální buněčné kultury pro množení polioviru (17) byly zaznamenány degenerativní změny v morfologii buněk. Nejprve popsal Robbins et al. (48) v roce 1950, tyto cytopatických změn patří jaderné srážení, kondenzace chromatinu, mobilní zaokrouhlení, a propuštění z jednovrstvé, s eventuální progrese do acidofilních cytoplazmy, jaderné pyknosis, a fragmentace jaderného chromatinu (karyorhexe) (47).

nedávné pochopení mechanismů buněčné smrti připravuje půdu pro vyšetření proteinů smrti hostitelských buněk a jejich možnou roli v CPE infekce CVB3. Mnoho virů inhibuje nebo aktivuje buněčnou smrt, strategie, které vyjadřují charakteristické aspekty poškození buněk, zánětlivé reakce nebo virová perzistence. Jak bylo uvedeno výše, předchozí pikornavirus studie ukázaly, že morfologické znaky apoptotickou smrt buněk, včetně buněk zmenšování, fragmentaci DNA a jaderné kondenzace (21, 32, 47).

Kaspáza 3, cystein proteáza s homologií k proteinu Caenorhabditis elegans CED – 3 (77), je považován za jeden z klíčových proteinů zapojených do fáze provádění buněčné smrti. Apoptóza indukovaná více podněty, včetně Fas, TNF, etoposidu, staurosporinu, fotodynamické terapie, ionizujícího záření a stažení růstového faktoru, zahrnuje zpracování pro-kaspázy 3 a následnou aktivaci (15, 23, 30, 33, 51). Počínaje 7 až 8 h postinfekcí CVB3 je pro-kaspáza 3 vyčerpána a testy aktivace kaspázy prokázaly, že tento protein je štěpen na svou aktivní formu. Několik proteiny mohou aktivovat kaspázy 3, včetně kaspázy 8 (prostřednictvím signalizace přes TNF nebo Fas receptory), (55), granzyme B z cytotoxických lymfocytů (62), a kaspázy 9 (přes uvolnění mitochondriálního cytochromu c a shromáždění apoptotických proteáz aktivační faktory) (36). Po aktivaci kaspázy 3 může snížit specifické substráty, což má za následek strukturální změny a ztráty homeostatické regulaci buněčných procesů. Bylo prokázáno, že četné proteiny jsou štěpeny aktivovanými kaspázami. V souladu s aktivací kaspázy 3 se PARP i DFF štěpí po infekci CVB3. Aktivace kaspázy a fragmentace DNA jsou přímo spojeny štěpením DFF (37). DFF je lidský cytosolický faktor sestávající ze dvou podjednotek 45 a 40 kDa, z nichž větší je kaspázou 3 degradována na menší polypeptidy. V nedávných studiích enari et al. (16) pomocí buněk myšího lymfomu byla izolována endonukleáza, kaspázou aktivovaná Dnáza (CAD). Myší ekvivalent dff proteinu byl izolován a označován jako inhibitor CAD (50). Štěpení inhibitoru CAD (dff) kaspázou 3 umožňuje jadernou translokaci CAD a degradaci DNA. DFF se štěpí počínaje 9h postinfekcí, což vede k fragmentu 30-kDa (obr. 3), které mohou být dále zpracovány na fragment 11-kDa (37). PARP se nachází v jádru a podílí se na opravě DNA. Štěpení PARP začíná v 9 h po infekci, což naznačuje, že jednou caspases jsou aktivovány v cytosolu, jsou schopni přístup jádro-lokalizované substráty.

za zmínku stojí inhibice kaspázy s obecným inhibitorem kaspázy ZVAD.fmk nezabránila CPE vyvolané CVB3 po infekci. U postinfekce mezi 6 a 7 h SE CPE projevila kontrastní mikroskopií v našem modelu infekce CVB3. Doba mezi infekcí a výskytem CPE, jak bylo pozorováno kontrastní mikroskopií, byla u ZVAD konzistentní.koncentrace fmk od 50 do 200 µM. Kromě toho, že neovlivňuje čas na CPE, ZVAD.léčba fmk vedla k buňkám s morfologickým vzhledem podobným vzhledu neošetřených infikovaných buněk (obr. 5). Léčbu BPD-MA a světlem jsme použili jako alternativní metodu indukce apoptózy v buňkách HeLa (22, 23). Inhibice aktivace kaspázy inhibitorem ZVAD.fmk zabránila apoptotickému fenotypu (obr. 5). Z těchto výsledků jsme došli k závěru, že kaspázy aktivitu a štěpení substrátů není účet pro charakteristické CPE spojené s pikornavirus infekce, ale místo toho jsou aktivovány po morfologické změny.

průsečík virového replikačního cyklu a aktivace dráhy smrti hostitelských buněk je třeba určit. Infekce pikornavirem brzy vede k inhibici buněčné RNA a syntézy proteinů (19, 74). Dřívější studie vztahů mezi pikornavirus indukované metabolické změny a virus-indukované CPE uvedeno, že inhibice proteinu a RNA syntézy byl přímo nesouvisí s mobilní morfologických změn (4). Bílkovin a RNA, syntézu inhibitorů zpoždění smrt buněk, ale buňky zobrazí méně morfologické změny než pikornavirus-infikovaných buněk (5). Inhibice syntézy proteinů a RNA některým z více činidel, jako je aktinomycin D, puromycin a toxin záškrtu, vede k apoptóze (39). Rané studie provedené v polioviru infekce systémů ukázala, že puromycinu, inhibitor překlad virové, stejně jako hostitelské proteiny, oddaluje nástup cytopatických změn, což naznačuje, že některé virové proteiny mohou být přímo cytotoxické (4). Zvýšení MOI vede k rychlejšímu nástupu CPE (nepublikované pozorování), i když téměř všechny hostitelské bílkoviny překlad je vypnout během 3 h při relativně nízké MOI (25) takové, jako v této studii (MOI = 5). V poslední době bylo prokázáno, že 2B protein kódovaný genem coxsackievirus a polioviru společníci s buněčnou membránou frakce, včetně plasmalemma a endoplazmatického retikula, a narušuje iontové pohybu, včetně pohybu Ca2+ do cytosolu (1, 67). K přílivu Ca2+ dochází při apoptóze (7, 44), ale není jasné, zda k přílivu dochází před nebo po aktivaci kaspázy. Zkoumáním iontových požadavků kaspáz bylo zjištěno, že koncentrace iontů vápníku má malý vliv na aktivitu kaspázy (56). Rané vápníku příliv následující coxsackievirus infekce může vyplývat z vlivu 2B bílkovin na membránové propustnosti a velké zpoždění vápníku příliv poznamenal (>6 h postinfection) (67) by mohl být následný účinek aktivace kaspázy.

během časných fází infekce by bylo výhodné, aby virus inhiboval smrt hostitelských buněk, což by umožnilo maximální produkci virového potomstva. V pozdních stádiích virového životního cyklu by bylo také prospěšné, aby virus spíše vyvolával apoptózu než nekrózu. Takový mechanismus smrti je potenciálním prostředkem úniku imunitního systému hostitele virem během jeho uvolňování do okolní tkáně. Apoptóza je charakterizována rychlou fagocytózou postižených buněk bez uvolňování prozánětlivých cytokinů (53).

bylo prokázáno, že viry interagují na různých úrovních apoptotické dráhy. Několik gammaherpesviruses (včetně Kaposiho sarkom související lidský herpesvirus 8), stejně jako tumorigenní molluscum contagiosum virus obsahují FLICE-inhibiční proteiny, které interagují s Fas adaptér protein FADD a soutěžit inhibovat kaspázy 8 nábor a následné aktivace (61). Vyjádření kravskými neštovicemi virus serpin CrmA blokuje kaspázy 8-zprostředkované aktivaci navazujících caspases, jako jsou kaspázy 1 a kaspázy 3 (55). IAP (inhibitory apoptózy) proteiny tvoří rodinu proteinů, vyjádřené baculoviruses, že blok apoptózy indukované virovou infekcí nebo kaspázy 1 (78). Dále bylo objeveno několik virových homologů rodiny proteinů Bcl-2(2, 8, 20, 70). Adenovirus (9, 20, 57), virus Afrického moru prasat (41), a virus Epstein-Barrové (26, 41, 59) kódují proteiny (E1B-19K, LMWS-HL, a BHRF1, v tomto pořadí), které vykazují sekvenční homologie pro přežití genů Bcl-2 rodiny.

identifikace virových proteinů, které přímo indukují apoptózu, není tak rozsáhle dokumentována jako identifikace virových proteinů, které inhibují buněčnou smrt. Na lentiviruses lidské imunodeficience virus lidské T-buněčné leukémie virus typ 1 kódují transkripční regulátory Tat a Daně, které bylo prokázáno, že zvýšení exprese Fas ligandu, zatímco snížení exprese Bcl-2 členy rodiny (79, 80). Lidské adenovirem kódované genové produkty E1A, E3 a E4 způsobují buněčnou smrt po expresi v buněčné kultuře. Geny vyvolávající smrt adenoviru jsou exprimovány pozdě v infekčním cyklu a nakonec přemohou geny inhibující smrt kódované virem (38).

naše data ukazují, že aktivace kaspázy 3 následuje, spíše než předchází, degenerativní morfologické změny vyvolané CVB3 v infikovaných hela buňkách. Aktivované kaspázy zpracovávají specifické substráty, včetně PARP a DFF. Inhibice aktivity kaspázy však nevylučuje morfologický vzhled (CPE) buněk infikovaných virem, jak je stanoveno kontrastní mikroskopií. Zpracování kaspázy a štěpení substrátů mohou být důležité pro konečnou změnu normálních homeostatických procesů v infikovaných buňkách a mohou usnadnit konečnou clearance buněk infikovaných virem. Virové proteázy, 2A, 3C, a 3CD může štěpit specifické strukturální proteiny, což vede k morfologické změny v souladu s CPE, způsobem, který je analogický k působení caspases, který štěpí samostatné substráty pro dosažení odlišné apoptotických fenotyp.

• Copyright © 1998 americká společnost pro mikrobiologii