Sloučeniny,

ALDH1A1 inhibitory byly nedávno described30. Inhibitory LDHA byly dříve popsány v Rai et al.29. Inhibitory IDH1 byly dříve popsány v Urban et al. a Davis a kol.24,36. Jiné sloučeniny použité ve studii byly Methotrexát (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomine (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857), a LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Pro qHTS byly sloučeniny v vyšetřovací desce mechanismu (MIPE) testovány v 11 bodech (intraplate, ředicí faktor 1:3). Sbírka inhibitorů kinázy obsahující 977 inhibitorů kinázy byla testována v 7bodových dávkách (interplate, ředicí faktor 1:5). Ve všech případech byl jako vozidlo použit DMSO.

klonování

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Otevřené Čtecí Rámce (Orf) genů zájmu byly klonovány do akceptor páteř pomocí BamHI/EcoRI (N-terminální) nebo NheI/BamHI (C-terminální) stránky pomocí PCR amplifikaci kódující oblasti s Infuzí kompatibilní oligonukleotidy, podrobně vymezeny v Doplňkové Tabulce S1. Konstrukce IDH1, LDHA, DHFR, GC a ALDH1A1 byly připraveny genovou syntézou (ThermoFisher) v pcDNA3. 1 (+). Pro klonování brány (pouze konstrukty IDH2) byl cílový vektor obsahující značku 86b vytvořen nahrazením značky v5 v pcDNA3. 2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‚scar‘ after the final amino acid of the ORF, which encodes „LPTFLYKVVDLEGPR“ prior to the 86b tag.

Buněčné kultury

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468 a HT-29 byly buňky získané z ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132, a HTB-38, v uvedeném pořadí). HuCC-T1 a CC-LP-1 byly laskavým darem Dr. N. Bardeesyho (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T buňky byly kultivovány v DMEM (4,5 g/L glukózy) s 10% fetálního bovinního séra (FBS), 6 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvát sodný, 50 U/mL penicilinu a 50 µg/mL streptomycinu. Buňky LN18, HT-29, CC-LP-1 a HeLa byly kultivovány ve výše uvedeném médiu bez pyruvátu sodného. Buňky OV-90 byly kultivovány ve směsi 1:1 média MCDB 105 (Cell Applications Inc.) a médiu M199 (HyClone, GE), doplněné 15% FBS, 1% Penicilin-Streptomycin (Life Technologies), a konečné koncentrace 1,85 g/L hydrogenuhličitan sodný (HyClone, GE). 22RV1, HuCC-T1, a MDA-MB-468 buňky byly pěstovány v RPMI 1640 doplněným 10% FBS, 6 mM L-glutaminu, 100 jednotek/mL penicilin, 100 µg/mL streptomycinu. Všechny buňky byly pěstovány při 37 °C ve zvlhčené inkubátoru udržována na 5% CO2 a negativní test na mycoplasma pomocí MycoAlert detection kit (Lonza).

produkce a purifikace rekombinantních proteinů a peptidů

11s a 86b proteiny byly produkovány GenScript. Pro rekombinantní fragment 11S byla kódující sekvence DNA fúzována s tagem 6x His pro usnadnění následného čištění a sekvence byla subklonována do expresního vektoru E. coli. Buňky BL21 Star (DE3) byly transformovány rekombinantními plazmidy a jedna kolonie byla naočkována na LB médium obsahující IPTG pro indukci exprese proteinu. Analýza SDS-PAGE a Western blot byla použita ke sledování výrazu a výběru optimálního načasování sklizně. Buňky byly sklizeny centrifugací a pelety byly lyzovány sonikací. Po jeho očištění byly frakce sterilizovány filtrem 0,22 µm. Proteiny byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a Western blot s použitím standardních protokolů a myš-anti-Jeho mAb (GenScript, Kat.Ne.A00186). Koncentrace purifikovaného proteinu byla stanovena pomocí Bradford protein assay s BSA jako standardu. Protein byl skladován v 1X PBS, 10% glycerol, pH 7.4, a čistota byla přibližně o 90%, jak odhadují densitometric analýza Coomassie Blue-barevné SDS-PAGE gel pod redukční podmínky. Peptid 15 aminokyselin 86b byl uložen v ultrapure dH2O a byl 99,9% čistý HPLC.

Nízkou propustností (96-well PCR destičky nebo proužky) CETSA doplnění test

Buňky byly transfektovaly v 6-no pokrmy s použitím reverzní postup transfekce, kde 1.25 ml komplexy (6.25 µL Lipofectamine 2000 a 3 µg DNA na jamku) byl v kombinaci s 1,25 ml HEK293T buněčné suspenze (1 × 106/mL, 1.25 × 106 buněk celkem). Pro CDK9 byly použity 2 µg DNA na jamku. Po 24 h (48 h pro CDK9), buňky byly sklizeny pomocí trypsinization a resuspendovány v 1 × 106 buněk/mL (pokud není uvedeno jinak) v CETSA vyrovnávací paměti obsahující DPBS (CaCl2 a MgCl2) a 1 g/L glukózy, 1X Zastavení koktejl inhibitoru proteázy (ThermoFisher), a 0,5% DMSO (DMSO nebyl přidán pro experimenty, které obdržel následující sloučeniny a ošetření vozu). Pro experimenty s teplotním rozsahem (bez sloučeniny nebo jednorázové dávky) byly vzorky alikvotovány na PCR proužky při 30 µL na zkumavku. Sloučenina byla přidána a buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 h. Vzorky pak byly vytápěny na 3.5 min za použití předehřátého tepelného cykleru se nechá vyrovnat na pokojovou teplotu a do každé jamky se přidá 6 µL 6% NP40. Pro zmrazení-rozmrazení experimenty, zkumavky byly umístěny do hliníkové PCR bloku na suchý led/ethanol lázni po dobu 3 min. následuje inkubace při 37 °C po dobu 3 min, třepačce po dobu 3 sec, a tyto kroky opakovat, tři další časy. Byly přidány 11s (GenScript) a furimazinový substrát (z Nano – Glo Luciferase Assay System, Promega) v konečných koncentracích 100 nM a 0.5X, respektive, a vzorky byly analyzovány na luminiscence intenzity pomocí ViewLux Vysokou propustností CCD imager (Perkin Elmer) vybaven jasné, filtry.

384-no CETSA test

Buňky byly transfektovaly v T75 baněk pomocí reverzní postup transfekce, kde 9 mL komplexy (45 µL Lipofectamine 2000 a 22,5 µg DNA) v kombinaci s 10 mL HEK293T buněčné suspenze (1 × 106 buněk/mL, 10 milionů buněk celkem). Po 24 h byly buňky sklizeny trypsinization, resuspendované v 1 × 106 buněk/ml, jak je popsáno výše a vydávány (15 µL buněk na jamku) do 384-well PCR destičky (Roche) pomocí Multidrop Combi (ThermoFisher). Sloučeniny (63 nL) nebo DMSO ovládání vozidla (63 nL) byly následně připnul pomocí pin nástroj (GNF) a inkubovány 1 h při 37 °C. Destičky byly uzavřené a vytápěné na uvedené teplotě za 3,5 min a ochladí se na 25 °C pomocí AB qPCR přístroj (Roche) pomocí rampy rychlostí 1,5 °C/s ohřevu a max rampa sazba pro chladící fáze. Tři µL 6% NP40 byly přidány za dobře a inkubovány po dobu 30 min umožňují lýzu buňky s následným přídavkem 11S a furimazine substrátu (v konečné koncentraci 100 nM a 0,5 X, respektive). Vzorky byly analyzovány na intenzitu luminiscence pomocí čtečky ViewLux.

1,536-no CETSA test

Buňky byly transfektovaly a sklizeny jako výše (384-no protocol). Buňky byly vydávány (5 µL buněk na jamku) do 1,536-no bílé talíře (Aurora, cyclic olefin polymer, kočka# EWB041000A) pomocí Multidrop Combi. Sloučeniny (23 nL) byly následně připnul pomocí pin nástroj (Wako Automatizace) a inkubovány 1 h při 37 °C. Destičky byly vytápěny na uvedené teplotě a čase pomocí termobloku (viz níže) a ochladí se na 25 °C. Jeden µL 6% NP40 byl přidán za dobře a destičky byly inkubovány po dobu 30 min umožňují lýzu buňky s následným přídavkem 3 µL 11S (konečná koncentrace 100 nM) a furimazine substrátu. Desky byly odstředěny a analyzovány na intenzitu luminiscence pomocí čtečky ViewLux. Pro obrazovky LDHA a CDK9 konečná koncentrace 0,5 X a 0.Byl použit 25X furimazin. Normalizační kontroly zahrnují vzorky ošetřené DMSO a gsk2837808a nebo nevyhřívané vzorky pro LDHA a CDK9. Na CDK9 counterscreen byla provedena jako výše, s následujícími rozdíly: 5 µL untransfected HEK293T buňky (1 x 106/mL v CETSA pufru) byly vydávány do 1,536-desky následuje složené toho, 37 °C inkubace, topení a lýza kroky jako výše. Následně bylo do jamek přidáno 500 pM (konečné) 86b, následovalo přidání 100 nM 11S a 0,25 x furimazinového substrátu (konečné).

hliníkový blok pro vytápění 1,536-deska byla navržena měřící deska pro určení rozměrů plochy ohraničené tvarovanou-v výztužných žeber v X a Y, a spodní stejně obličeje a dolní příruby tvář v Z. Pak blok obráběné z 6061 T6 hliníkové desky byla tvarované, což by bylo bez záchvatu přibližně 0,5 mm vůle pro desky ve všech osách. Blok byl obroben pomocí ručního vertikálního frézovacího stroje, koncových mlýnů a čelního mlýna. Pro experimenty s ohřevem pece byly desky umístěny do středního stojanu konvekční laboratorní pece (Termofisher) a pokryty kovovými víčky, aby se minimalizovalo odpařování.

CETSA v buněčné lyzáty

Buňky byly shromážděny v CETSA vyrovnávací paměti při 1,0 x 106 buněk/mL (jak je uvedeno výše) a NP40 byl přidán do výsledné koncentrace 0,4%. Po rotaci vzorků na konci po dobu 30 minut (pokojová teplota) byly lyzáty vyčištěny centrifugací při 20 000 × g po dobu 10 minut (4 oC). Kofaktor (např. NAD+) byl přidán do vyčištěného lyzátu. Pro experimenty s teplotní odezvou bylo 25 µL lyzátu přeneseno do PCR zkumavek a zahříváno po dobu 3,5 min na různé teploty. Pro izotermický dávka-odpověď experimenty, 5 µL přečištěného lyzátu byl dávkován do 1536-desky pomocí BioRAPTR FRD pracovní stanice a vzorky byly zahřáty na hliníkový blok. Vzorky byly povoleny vyrovnat na pokojovou teplotu a substrát byl přidán (konečná koncentrace: 100 nM 11S, 0,5 X furimazine). Luminiscence byla zachycena pomocí zobrazovače ViewLux, jak je uvedeno výše.

Western blot

Vzorky byly zpracovány, jak je uvedeno v low-propustnost doplnění testu sekce, pomocí zmrazovacích cyklů pro lysin. Lyzáty byly centrifugovány na 15,200 × g po dobu 20 min při teplotě 4 °C. Vzorky byly běh na 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (ThermoFisher) pomocí MOPY pufru a přeneseny na PVDF membránu pomocí iBlot 2 systém přenosu na 25 V po dobu 7 min. Membrány byly blokovány 5% mléka roztok (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0.1% Tween-20) a primární protilátky byly inkubovány přes noc při 4 °C v blokování řešení. Protilátky byly: anti-IDH1 (, Buněčné Signalizace #8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Buněčné Signalizace #3582, 1:1000). Anti-králík/myš-HRP (králík = buněčná Signalizace 7074; myš = buněčná Signalizace # 7076) byl přidán na 1:2500 a inkubovány 1 h při pokojové teplotě. Chemiluminiscenční signál byl generován Supersignálním roztokem west dura (ThermoFisher)a zachycen pomocí systému Biorad Chemidoc. Denzitometrická analýza byla provedena pomocí softwaru Photoshop (Adobe).

2-Hg test

hek293t buňky reverzní transfekce ve 24 jamkách přidáním 2.5 × 105 buněk na transfekčních komplexech (0,75 µg plazmidové DNA, 1,5 µL Lipofektaminu 2000 na jamku). Buněčné kultivační médium bylo odebráno po 72 hodinách a 15 µL bylo přeneseno na 384 jamkovou neprůhlednou destičku. Do každé jamky bylo přidáno 1,5 µL 660 mM HCl a vzorky byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Do každé jamky bylo přidáno 1,5 µL 720 mM Tris-HCl báze. Pak, 52 µL 2-HG detekce roztoku (100 mM HEPES (pH 8.0), 100 µM NAD + , 1 µg/mL aktivní rekombinantní D-2-Hydroxyglutarate dehydrogenázy (D2HGDH; Biovision, Kočka: P1001), 5 µM resazurin, 0.03 mg/mL diaphorase (Sigma, Kat: D5540) se přidá a deska se inkubuje při pokojové teplotě. Byla připravena standardní křivka 2-HG ve 100 mM HEPES (pH 8,0). Fluorescence byla měřena na čtečce ViewLux pomocí filtrů Ex: 525, Em: 598/25.

biochemické testy

biochemický test LDHA byl proveden, jak bylo dříve popsáno29. Stručně řečeno, 3 µL lidské laktátdehydrogenázy 5 (2 nM final) (č. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) v LDH testu pufr (200 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 µM EDTA a 0,01% Tween-20) bylo přidáno do černé pevné dno 1536-test desky (Greiner Bio-One). Po přenosu sloučeniny pin (23 nL) byl k zahájení reakce dávkován 1 µL roztoku substrátu obsahujícího NADH (0,06 mm Finální) a pyruvát sodný (0,2 mM Finální) (Sigma-Aldrich) v LDH testovacím pufru. Po 5 minutách inkubace při pokojové teplotě byl do každé jamky přidán 1 µL detekčního činidla. Desky byly okamžitě převedeny na ViewLux čtenáře a všechny výsledné resorufin fluorescence byla měřena (ex 540 nm, em 590 nm) na 0 a 10 min. Fluorescence byla normalizována pomocí kontrolních jamek bez enzymů a DMSO ošetřených na každé desce.

biochemický test ALDH1A1 s použitím neoznačeného proteinu byl proveden,jak bylo dříve popsáno31, 37. Krátce, 3 µL 20 nM čistí lidské ALDH1A1 v assay pufru (100 mM HEPES pH 7.5 s 0,01% Tween 20) byly vydávány do 1,536-pevný-spodní černá deska (Greiner Bio One). Dvacet tři nl sloučenin nebo kontrolní pozice 11-7085 bylo přeneseno pomocí nástroje pin (Wako Automation). Vzorky byly inkubovány (při pokojové teplotě, chráněné před světlem) po dobu 15 minut a následovalo 1 µL substrátu přídavkem NAD + a Propionaldehydu (konečné koncentrace 1 mM a 80 µM). Desky byly odstředěny a číst v kinetické režimu na ViewLux snímač vybaven excitace 340 nm, 450 nm, emisní filtry pro 5 min. Změna intenzity fluorescence během 5 minut byla normalizována pomocí kontrolních jamek bez enzymů a DMSO ošetřených na každé desce.

test vazby kinázy tr-FRET Lanthascreen Eu pro CDK9 / cyklin K byl zakoupen od společnosti ThermoFisher a proveden podle pokynů výrobce. Krátce, 4 µL master mix obsahující 4 nM CDK9/Cyklin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM, Biotin Anti-Jeho Ab, 2 nM, Eu-Streptavidin, a 10 nM Kinázy Tracer, 236 Řešení v 1X Kinázy Vyrovnávací paměti byly vydávány do Greiner 1,536-bílá střední závazné desky pomocí BioRAPTR FRD pracovní stanice. Dvacet tři nL krmných a ovládací prvky (DMSO a LY2857785 v konečné koncentraci 6 µM) byly okamžitě dodány do testu desky přes pin nástroj pro převod. Desky byly nechá se inkubovat po dobu 1 h při pokojové teplotě, a TR-FRET fluorescence byla následně měřena s PerkinElmer Představit Multilabel plate reader (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Prodleva 100 µs; Integrace dobu 200 µs).

test produkce laktátu

buňky HEK293T byly kultivovány, jak je popsáno výše. Buňky byly opláchnuty PBS, trypsinizovány a resuspendovány ve FENOLOVĚ červené DMEM (Life Technologies) bez doplňků. Buňky byly okamžitě á do 1536-černý čirý spodní destičky (Corning) v 250 buněk na jamku ve 4 µL objemu. Sloučeniny nebo řízení vozidla byl přidán do jamek přes pin nástroj pro převod a buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 h. Dva µL laktátu reakční směsi (Biovision K607-100) bylo přidáno do každé jamky a desky byly pokryty a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 30 min. Fluorescence byla měřena pomocí zobrazovače ViewLux microplate vybavené filtry Ex / Em 528/598 nm.

Aldefluor test

Pro počáteční stanovení 86b-tagged ALDH1A1 činnost, buňky byly transfektovaly pomocí reverzní postup transfekce, kde 1 mL komplexy (6 µL Lipofectamine 2000 a 3 µg DNA) v kombinaci s 1 mL LN18 buněčné suspenze (5 × 105/mL) a 100 µL/jamka mix byl dávkován do černé, čiré-spodní 96jamkové destičky (Corning). Po 24 h, médium bylo odstraněno a nahrazeno 100 µL/jamka Aldefluor pufru (STEMCELL Technologies) obsahující BAAA substrátu a Hoechst 33342 (ThermoFisher, finální koncentrace 500 nM a 0,5 nM, v uvedeném pořadí). Následně byl přidán DMSO nebo DEAB (1 µM final) a destičky byly inkubovány po dobu 30 minut při 37 °C, aby se umožnila přeměna BAAA na BAA. Buňky byly promyty a 100 µL/jamka Aldefluor pufru byl vydán před zobrazování na Mobilní 2200 (GE Healthcare). Pro vysokou propustností testy, LN18 buňky byly transfektovaly v T75 baněk pomocí reverzní transfekci postup, jak je popsáno výše pro vysokou propustností HEK293T CETSA testy. Po 16 h byly buňky sklizeny a, á (1000 buněk/no/5 µL) do černé, optické kvality jasné dno, TC léčených 1,536-no desek (Aurora mikrotitrační destičky) pomocí Multidrop Combi dávkovač a inkubovány přes noc při 37 °C. vysoký obsah Aldefluor test byl následně proveden na transfektovaly LN18 buňky nebo untransfected OV-90 jako dříve described31. Obrázky byly analyzovány pomocí In Cell Investigator v1.6.2 analysis software ‚ s canned Multi-Target Analysis algorithm (GE Healthcare), jak je popsáno.

Membrána tepelné integrity test

30,000 HEK293T buňky byly připraveny v 30 µL CETSA vyrovnávací paměti obsahující 1X koktejl inhibitoru proteázy (ThermoFisher) doplněné o 0,5% DMSO (1.5% DMSO celkem). Pro experiment tolerance DMSO byl DMSO přidán k DPBS při 0, 1, 2 nebo 3%. Buněčné suspenze byly vytápěny za 3,5 min při 42 až 74 °C, použití 4 stupně intervalech, pak se odstraní na hliníkovém bloku na mokrém ledu. Buněčné suspenze byly smíchané s stejných dílů Trypanovou Modří (LONZA) ( = 0.2% trypanovou modří) a počítá okamžitě pomocí C-chip hemocytometer (iNCyto, Korea). Byly započítány Trypan pozitivní (permeabilizovaný) a negativní (neporušený), s n = 2 při každé teplotě. Pro další buněčné linie byl připraven jeden milion buněk ve 100 µL fenol-červeného volného DMEM obsahujícího 1% DMSO. Buňky byly zahřívány po dobu 3 minut na 42 až 90 °C ve 4 stupňových intervalech, poté byly odstraněny do hliníkového bloku na mokrém ledu. Integrita membrány byla hodnocena výše popsaným způsobem.

PAMPA

metoda míchání s dvojitým umyvadlem PAMPA patentovaná společností Pion Inc. (Billerica, MA) byla použita k měření propustnosti sloučenin, jak bylo dříve popsáno38. Sloučeniny byly zředěny v donorových a akceptorových roztocích pufrovaných na pH7. 4 a koncentrace DMSO byla 0,5%. Výpočty propustnosti byly provedeny pomocí Pion Inc. software.

qhts analýza

Data z každého testu byla normalizována podle tabulky na odpovídající kontroly, jak bylo popsáno dříve39. Stejné kontroly byly také použity pro výpočet z ‚ faktoru pro každý test. Procentuální aktivita byla odvozena pomocí interního softwaru (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Všechny křivky koncentrace a odezvy byly namontovány a AC50 byly vypočteny pomocí softwaru GraphPad Prism; křivky byly klasifikovány tak, jak byly dříve popsány27. Plocha pod křivkou (AUC) byla vypočtena pomocí lichoběžníkového pravidla pro přibližnou plochu mezi křivkou odezvy a osou x v rozmezí koncentrací. Ekvivalentní rozsahy koncentrací byly použity pro všechny sloučeniny v rámci experimentu. Pro klasifikaci účinných látek byl použit limit účinnosti 3 σ od průměru (kontroly vehikula).