Abstrakt
Cervicitis je častou pohlavně přenosnou chorobou. V posledních letech zneužívání antibiotik při léčbě cervicitidy vede ke vzniku bakterií rezistentních na antibiotika, je třeba vyvinout alternativní strategie. V tomto výzkumu jsme zkoumali účinky Feilin Vaginal Gel (FVG), čínského bylinného vzorce, na léčbu cervicitidy. Dva modely cervicitidy byly optimalizovány pomocí myši BALB/c; jeden model in vitro byl vytvořen v buňkách HeLa. V modelu cervicitidy vyvolané Chlamydia trachomatis byla pozorována vysoká úroveň bakteriálních zátěží, zánět v tkáni a cytokiny v séru. Při podávání FVG by bakteriální zátěž v cervikálním hlenu a tkáni děložního čípku mohla být významně inhibována způsoby závislými na dávce. Patologické poškození děložního čípku a vagíny, stejně jako hladiny IL-2, IL-17 a MCP-1 v séru, by mohly být zmírněny FVG. FVG snížil počet inkluzí indukovaných C. trachomatis v buňkách HeLa. Kromě toho by histologické poškození modelu cervicitidy vyvolané Escherichia coli a Staphylococcus aureus mohlo být sníženo FVG. Tyto výsledky naznačují, že FVG je schopen léčit cervicitidu inhibicí patogenů a regulací imunitní odpovědi hostitele. FVG může přispívat jako alternativní látka k léčbě cervicitidy.
1. Úvod
cervicitida je běžné pohlavně přenosné onemocnění se zánětlivým stavem děložního děložního čípku . Infekce děložního čípku začíná od dolního genitálního traktu (pochvy) a poté se vyvine do zánětlivého onemocnění pánve se vzestupnou infekcí horního genitálního traktu (dělohy a vejcovodů) a peritoneální dutiny. Cervicitida se často vyskytovala jako asymptomatická infekce. Abnormální cervikální nebo vaginální mukopurulentní výtok a cervikální ektopie mohou být příznaky a příznaky cervicitidy u některých pacientů . Závažná cervicitida však může vést k další neplodnosti a mimoděložnímu těhotenství. Cervicitida je považována za spojenou s přenosem infekce HIV a vývojem cervikálních karcinomů .
děložního hrdla mohou být způsobeny různými patogeny, jako jsou Chlamydie trachomatis, Neisseria kapavka, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas, Herpes simplex virus, cytomegalovirus, adenovirus . Infekce C. trachomatis je hlášena jako nejčastější příčina cervicitidy. U více než 10% žen s cervicitidou je diagnostikována infekce C. trachomatis a počet těchto infekcí se v posledních desetiletích stále zvyšuje . C.trachomatis je gramnegativní obligátní intracelulární bakterie. Ve vývojovém cyklu lze nalézt dvě formy C. trachomatis. Připojení elementárních těl (EBs) k hostitelským buňkám zprostředkovává invazi C. trachomatis. Uvnitř hostitelských buněk tvoří C. trachomatis retikulární těla (RBs) a poté se RBS replikuje v cytoplazmatické vakuole a nakonec tvoří inkluzi .
chlamydie může přetrvávat po dlouhou dobu v děložním děložním čípku bez příznaků. Infekce může spontánně vymizet bez léčby nebo může způsobit cervicitidu. Clearance C. trachomatis vyžaduje odpovědi imunity Th1 . Reakce adaptivní imunity však mohou mít dvojsečnou povahu a způsobit poškození tkáně. Léčba infekce C. trachomatis je založena na léčbě pacientů a jejich sexuálních partnerů makrolidy. Zneužívání antibiotik a falešně pozitivní diagnostiky může přispět ke vzniku organismů rezistentních na antibiotika. Bakterie rezistentní na antibiotika naopak vedou k selhání léčby . Po léčbě antibiotiky bude 10% -20% pacientů trpět reinfekcí během jednoho roku, což může být způsobeno absencí ochranné imunity proti chlamydiím . Vzhledem k těmto podmínkám je třeba vyvinout alternativní strategie.
Tradiční čínská medicína (TCM) má dlouhou historii v léčbě gynekologických onemocnění . Feilin vaginální Gel (FVG) je vyvinut z klinicky používaného vzorce čínské medicíny, který se používá k léčbě mukopurulentní cervicitidy. FVG se skládá z následujících rostlinných léčivých přípravků: Gentianae radix et rhizoma, Stemonae radix, cortex Fraxini, Paeoniae radix rubra, Dictamni kůry, a Glycyrrhizae radix et rhizome. Podle teorie TCM: FVG mohou být použity k léčbě hromadění vlhkosti a toxických materiálů, vyvolané abnormální poševní výtok, jako je vydatné, zapáchající, a nažloutlý leukorea, svědění, a bolest v okolí zevního genitálu . Byla studována extrakce, příprava a kontrola kvality FVG. Koncentrace gentiopicroside a paeoniflorin v FVG byly analyzovány na přibližně 5.90 mg/g a 8,96 mg/g, resp.
v této studii jsme testovali hypotézu, že FVG může účinně léčit cervicitidu. Pro hodnocení léčby FVG byly vytvořeny modely cervicitidy myší. V C. trachomatis infikovaných myší model, bakteriální zatížení, patologické zranění, a hladiny MCP-1, IL-2 a IL-17 v séru byly hodnoceny. Inkluze v buňkách HeLa indukované C. trachomatis byly vyjmenovány in vitro. Navíc po infekci směsí Escherichia coli a Staphylococcus aureus byla léčba FVG hodnocena histologickým vyšetřením děložního čípku.
2. Materiály a metody
2.1. Příprava FVG
šest bylinné léky byly extrahovány třikrát vařící vody a vysráží se alkoholu až 70% (v/v) ethanolu. Supernatant byl koncentrován s rotační odparce na relativní hustota 1.30-1.35 (50°C), aby se Feilin extrakce (FE, 5.62 g/g). Gelovou bází byla směs karbopol 941 a xanthanové gumy. Extrakce byla smíchána s gelovou bází, aby se získal FVG. Zatížení FVG léčivem bylo 2,5 g/ g, 1,25 g / g a 0,625 g/g.
2,2. Bakteriální Kmeny a Hostitelské Buňky
Chlamydia trachomatis myši pneumonitida kmen Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™) a Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) byly získány z American Type Culture Collection. E. coli a s. aureus byly kultivovány v živném vývaru. Lidské čípku epiteliální buněčné linie HeLa (ATCC® CCL-2™) byl zakoupen od Kultury Sbírka Čínské Akademie Lékařských Věd a kultivovány v RPMI 1640 médiu obsahujícím 10% FBS při 37°C v přítomnosti 5% CO2. C. trachomatis N byl množen v buňkách HeLa. Před infekcí byly infikované buňky HeLa (105 buněk/mL) narušeny a centrifugovány. Supernatant byl odebrán, aby se čištěné základních orgánů (EBs), který může být použit k infikovat myši a HeLa buňky přímo.
2.3. Infekce a léčba zvířat
120 samic BALB / C myší (18-20 g) bylo zakoupeno od Charles River Laboratories China (Peking, Čína). Zvířata byla umístěna v bariérovém zařízení pro zvířata BSL2. Všechny zde popsané experimentální postupy na zvířatech byly se souhlasem Institutu Čínské akademie čínských lékařských věd, čínské Materia Medica, Etický výbor. Referenční číslo etického schválení je 20162019.
tkáň děložního čípku myší BALB/C byla zraněna šikmou jehlou v anestezii. Myši byly poté naočkovány 50 µL C. trachomatis N nebo směsí E. coli a s. aureus (109 CFU / mL). Myši byly infikovány jednou denně a opakovány po dobu tří dnů. 24 h po poslední infekci, FVG byla dána do myši pochvy pomocí pipety (objem FVG, byla pečlivě kontrolována) v dávce 2,2 g/kg, 1.1 g/kg a 0,55 g/kg za 12 dní. Polykresulen čípky (PS), jako pozitivní kontrola, byl smíchán s gel základnu a se podává v dávce 16,5 mg/kg za 12 dní. Kontrolní skupina a modelová skupina dostaly stejný objem gelové báze. V den a den léčby byl cervikální hlen odebrán tamponem. 15. den byly myši anestetizovány, vzorky krve byly odebrány z aorty ventralis a sérum bylo odděleno. Myši byly poté usmrceny cervikální dislokací v anestezii a cervix a vagina byly odstraněny. Schéma experimentálního času bylo znázorněno na obrázku 1.
2.4. ELISA Analýza C. trachomatis, N, IL-2, IL-17, a MCP-1
tampony s hlenu děložního hrdla, byl rozptýlené se stejným objemem PBS, úroveň C. trachomatis N v PBS byla analyzována s enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Meilian, Shanghai, Čína) podle pokynů výrobce (přidat 50 µL vzorek 50 µL detekční protilátky do každé jamky a inkubujte při teplotě 37°C po dobu 1 hodiny; umýt jamky přidejte 100 µL HRP konjugátu do každé jamky a inkubujte při teplotě 37°C po dobu 0,5 hodiny; umýt jamek přidejte 50 µL chromogenní substráty do každé jamky, a inkubujte při teplotě 37°C po dobu 0,5 hodiny; přidat 50 µL stop roztoku do každé jamky; číst absorbanci každé jamky při 450 nm). Hladiny IL-2, IL-17 a MCP-1in v séru byly stanoveny Elisa kit (Meilian, Šanghaj, Čína) podle pokynů výrobce, jak je popsáno výše.
2.5. RT-PCR Analýza C. trachomatis N
Celková RNA byla extrahována z děložního čípku pomocí TRIzol (Invitrogen, Kalifornie, USA); expresi cílových genů byla analyzována pomocí Jednoho Kroku SYBR Prime Skript RT-PCR Kit II (TaKaRa, Peking, Čína) s Piko Skutečné 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Základní nátěry byly použity následovně: 16S rRNA forward primer, 5′ – ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3′; 16S rRNA reverzní primer, 5′ – GTT GAG CCC CGA GAT TTG AC-3′; gapdh forward primer, 5′ – GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′; gapdh reverse primer, 5 ‚- GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3‘. Relativní exprese genu C. trachomatis N A genu myši byla vypočtena podle metody.
2.6. Histologické vyšetření
tkáně myší byly fixovány 10% formaldehydem, poté vloženy do parafínu a nakrájeny na plátky pro barvení hematoxylinem a eosinem. Sekce byly vizuálně vyhodnoceny DMLB (Leica Camera AG, Wetzlar, Německo); z každého vzorku byly připraveny dvě sekce. Pro hodnocení patologických změn byla použita následující kritéria.
“ – “ epitel děložního čípku a pochvy nevykazuje žádnou hyperplazii a žádný zánět a tkáně nejsou normální.
“ + “ epitel děložního čípku a pochvy má mírnou hyperplazii; pojivová tkáň má mírný segmentální zánět.
“ ++ “ cervikální a vaginální epitel mají hyperplazii; pojivová tkáň byla infiltrována zánětlivými buňkami.
„+++ “ cervikální a vaginální epitel mají významnou hyperplazii a byly infiltrací zánětlivých buněk; pojivová tkáň byla obklopena difúzním zánětem a vaskulárním přetížením.
2.7. Hostitelské Buňky Infekce a Zařazení Skvrna
HeLa buňky byly nasazeny do 6-deska s hustotou 2×105 buněk/no a kultivovány po dobu 48 h. Pak byly buňky inkubovány s C. trachomatis, N EBs obsažené střední. Deska byla centrifugována při 32°C po dobu 1h a neustále kultivované při 37°C v přítomnosti 5% CO2 za 2h. Médium infikované buňky, byl nahrazen FE (500, 250 a 125 µg/mL) obsažené médiu a inkubovány po dobu dalších 48 h. Poté byly buňky promyty PBS, fixovány methanolem a obarveny Giemsou. Inkluze v buňkách HeLa byly zachyceny ix71 (Olympus, Tokio, Japonsko) a vyčísleny.
2.8. Statistická Analýza
Statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism v. 6 (GraphPad Software, Kalifornie, USA). Všechna data byla normálně distribuována (Kolmogorov-Smirnovův test). Inkluzní číslo a histologické skóre byly analyzovány pomocí testu Mann-Whitney U; ostatní byly analyzovány nepárovým t-testem. Hodnota p < 0,05 byla považována za významnou.
3. Výsledky
3.1. FVG inhibuje hladinu C. trachomatis N v cervikálním hlenu
EBs C. trachomatis klíčí a tvoří RBs po invazi do hostitelských buněk. RBs se začnou množit po 7-21 dnech. Enzymová imunoanalýza je běžně používaná nekulturní metoda k diagnostice chlamydiové infekce . Analyzovali jsme hladinu C. trachomatis N v cervikálním hlenu, abychom vyhodnotili závažnost infekce myší.
v časném stádiu infekce C. trachomatis n nebyla pozorována žádná významná změna bakteriální zátěže. 10 dní po první infekci došlo ke zvýšení C. trachomatis N u myší by mohly být testovány. V den byla úroveň bakteriální zátěže významně vyšší než kontrolní skupina(Obrázek 2 (a)). S následnou léčbou FVG (2.2, 1.1, 0,55 g/kg), úroveň C. trachomatis N u myší hlenu děložního hrdla, může být silně inhibuje v závislosti na dávce chování (Obrázky 2(c) a 2(d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. FVG inhibuje zatížení C. trachomatis N v Čípku
V diagnostice chlamydiových infekcí, amplifikace nukleových kyselin technika včetně polymerázové řetězové reakce (PCR) je citlivější a specifičtější než enzym immunoassay . Proto jsme dále testovali zátěž C. trachomatis N u myších děložních čípků metodou RT-PCR. V den 15 byla exprese 16S rRNA C. trachomatis N u myší významně vyšší než kontrolní skupina (obrázek 3). Léčba FVG (2, 2, 1, 1 g / kg) po dobu 12 dnů by mohla silně inhibovat zátěž C. trachomatis n v děložním čípku (obrázek 3).
3.3. FVG snižuje C. trachomatis N-indukovaná cervicitida a vaginitida
infekce C. trachomatis u myší je vhodným modelem pro studium infekcí genitálního traktu. Infekce nedokáže vyvolat těžkou patologii genitálií horních cest. Patologie děložního čípku a vagíny byla analyzována, aby charakterizovala závažnost infekce C.trachomatis N.
jak je znázorněno na obrázku 4, v kontrolní skupině byly epiteliální buňky a pojivová tkáň děložního čípku normální, nebyla pozorována žádná hyperplazie nebo zánět. V modelové skupině mají epiteliální vrstvy děložního čípku hyperplazii a zánětlivé buňky byly infiltrovány do epitelu a pojivové tkáně. Po léčbě FVG (1, 1 g / kg)by mohlo být patologické poškození děložního čípku významně sníženo (obrázek 4).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
Jak je znázorněno na obrázku 5, v kontrolní skupině byl vaginální epitel normální, nebyla pozorována žádná hyperplazie nebo zánět. V modelové skupině mají vrstvy vaginálního epitelu hyperplazii a zánětlivé buňky byly infiltrovány do tkáně epitelu. Po léčbě FVG (2, 2, 1, 1 g / kg)by mohlo být poškození vagíny významně sníženo (obrázek 5).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4. FVG Snižuje Sérové Cytokinové Odpovědi C. trachomatis, N Infekce
cytokiny může být propuštěn do epitelové buňky a buňky imunitního systému po C. trachomatis infekce, z nichž většina pochází z Th1 buněk. Tyto cytokiny přispívají k imunitní odpovědi, ale vyvolávají patologické poškození . Hladiny cytokinu v séru byly testovány na podporu výsledků histologického vyšetření. V den byly hladiny IL-2, IL-17 a MCP-1 významně zvýšeny (obrázek 6). Tři dávky FVG by mohly účinně inhibovat uvolňování IL-17 a MCP-1. Produkce IL-2 mohl být downregulated tím, FVG v nízkých dávkách (1.1 a 0,55 g/kg).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.5. FVG snižuje počet Inkluzních buněk indukovaných C. trachomatis in Vitro
k proliferaci C. trachomatis dochází v hostitelských buňkách s tvorbou RBs. Inkluze může být vytvořena přibližně 12 h po infekci, která obsahuje počet RBs . In vitro inhibice FVG na infekci C. trachomatis N byla hodnocena s počtem zařazení. Po inkubaci buněk HeLa S C. trachomatis N po dobu 48 hodin bylo možné pozorovat inkluze se skvrnou Giemsa. Po léčbě FVG (FE)byl počet inkluzí významně snížen v závislosti na dávce (Obrázek 7).
3.6. FVG snižuje patologické poškození děložního čípku vyvolané E. coli a s. aureus
, i když C. trachomatis je uváděn jako nejčastější patogen cervicitidy, u pacientů s cervicitidou by mohly být izolovány anaerobní bakterie jako E. coli, s. aureus a Klebsiella pneumoniae . V naší předchozí práci byl vytvořen model cervicitidy potkanů infikovaný směsí E. coli, s. aureus a n. gonorrhea . V tomto výzkumu byl optimalizován model myší infikovaný směsí E. coli a s. aureus. 14 dní po první infekci se ukázalo, že děložní čípek je vážně infikován.
v kontrolní skupině byl cervikální epitel normální a nebyla pozorována žádná hyperplazie nebo zánět. V modelové skupině mají vnitřní vrstvy cervikálního epitelu hyperplazii a zánětlivé buňky (neutrofil a eosinofil) byly silně infiltrovány do tkáně epitelu. Po léčbě FVG (2, 2 a 1, 1 g/kg) může být zánět děložního čípku významně inhibován (Obrázek 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Diskuse
diagnóza cervicitidy je obtížná kvůli nedostatku zjevného příznaku. U některých pacientů bylo možné pozorovat abnormální mukopurulentní výtok a cervikální ektopii . V posledních desetiletích bylo založeno mnoho savčích modelů cervicitidy. Makaky, krysy a myši by mohly být použity k vytvoření modelu cervicitidy. K indukci cervicitidy by mohly být použity jak bakterie (C .trachomatis), tak chemické sloučeniny (fenol, kyselina octová). V tomto výzkumu byly optimalizovány dva modely myší. Po infekci C. trachomatis N byla bakteriální zátěž C. trachomatis N v cervikálním hlenu v průběhu času neustále zvyšována. Infekce C. trachomatis N by mohla vést k upregulaci cytokinů v séru a zánětu v tkáních vagíny a děložního čípku. Po infekci směsí E. coli a s. aureus mohlo být v patologické diagnostice zjištěno poškození děložního čípku.
klinicky byla antibiotika první volbou pro léčbu cervicitidy podle různých patogenů. Ale vznik rezistentních na antibiotika, jako je chinolon rezistentní C. trachomatis a N. kapavka, methicilin-rezistentní s. aureus a vankomycin-rezistentní E. coli se stává vážným problémem po celém světě kvůli zneužívání antibiotik . TCM může přispět alternativními strategiemi pro léčbu cervicitidy. V tomto výzkumu byly testovány účinky FVG na cervicitidu.
FVG je vaginální gel, gel základnu, což je směs karbopol 941 a xanthanová guma . V posledních letech se k léčbě cervicitidy používá mnoho komerčních vaginálních gelových přípravků čínského bylinného vzorce . Vaginální podávání léků je tradiční cestou podávání sliznic, kterou lze použít k léčbě lokálních i systémových onemocnění . Jako vaginální formulace lze použít tradiční přípravky, jako jsou čípky, gely, tablety, vaginální filmy, zavlažování a pesary . Jako jeden z nejpoužívanějších systémů podávání léků byly vaginální gely použity k přípravě mikrobicidů, antikoncepce, induktorů práce a pohlavních hormonů. Ve srovnání s jinými systémy podávání léků je vaginální gel bezpečnější a má vyšší biologickou dostupnost .
všech šest rostlinných léčivých přípravků v FVG lze použít k léčbě gynekologických onemocnění u TCM . Podle teorie TCM, v tomto vzorci, Gentianae radix et rhizome je „monarcha droga“ nebo „hlavní droga“, Stemonae radix a cortex Fraxini jsou „ministerské droga“ nebo „asistent lék“, Paeoniae radix rubra a Dictamni kůry jsou „adjuvantní lék“, a Glycyrrhizae radix et rhizome je „hlavní droga“. Oddenek Gentianae radix et může nejvíce přispět k účinkům FVG. Iridoidy a celkové glukosidy pivoňky jsou izolovány hlavně z Gentianae radix et rhizoma a Paeoniae radix rubra. Tyto sloučeniny vykazují významné protizánětlivé účinky . Alkaloidy a limonoidy přispívají k antibakteriální aktivitě Dictamni kůry . Kumariny v kůře Fraxini a flavony v Glycyrrhizae radix et rhizome vykazují antibakteriální a protizánětlivé účinky . Alkaloidy přispívají k insekticidní aktivitě Stemonae radix . Tyto bioaktivní sloučeniny těchto rostlinných léčivých přípravků mohou podporovat léčbu FVG při cervicitidě.
IL-17 je charakteristicky produkován Th17 buňkami. Klinicky je koncentrace IL-17 v genitálních sekretech pacientů infikovaných C. trachomatis významně vyšší než u neinfikovaných žen . Vysoká hladina IL-17 v myším modelu cervicitidy byla v souladu s klinickým výsledkem. Hladiny IL-2 a MCP-1 jsou spojeny s odpověďmi Th1. IL-2 se vylučuje z Th1 buněk a stimuluje produkci cytokinů. Existuje inverzní korelace mezi úrovní MCP-1 a TH1 odpovědí. Inhibice MCP-1 může zvýšit produkci IFN-γ . FVG může snížit koncentrace IL-2, IL-17 a MCP-1. Tyto výsledky naznačují, že FVG může inhibovat cervicitidu prostřednictvím regulace imunitní odpovědi hostitele.
Na počátku cyklu infekce C. trachomatis umožňuje systém sekrece typu III EBs napadnout hostitelské buňky . Po internalizaci C. trachomatis následuje vývoj RBs a inkluzí. Inhibitor sekrečního systému typu III by mohl blokovat tvorbu inkluzí . Studie in vitro prokázala, že FVG může inhibovat počet inkluzí v buňkách HeLa.
Na závěr jsme úspěšně založili dvě myši cervicitis modely s infekcí C. trachomatis, N, S. aureus a E. coli. Dokázali jsme, že FVG může významně inhibovat cervicitidu. FVG by mohl snížit bakteriální zátěž, zmírnit patologické poškození a snížit počet inkluzí. Účinky FVG byly spojeny s inhibicí patogenů a regulací imunitní odpovědi hostitele. Tento výzkum poskytuje důkaz, že FVG lze použít jako nové alternativní činidlo, které zmírňuje problém rezistence na antibiotika během léčby cervicitidy.
dostupnost dat
údaje použité na podporu zjištění této studie jsou zahrnuty do článku.
střety zájmů
autoři nemají žádné střety zájmů související s touto prací.
příspěvky autorů
Xin Mao a Ronghua Zhao k této práci přispěli stejně.
Poděkování
Tato studie byla podpořena Národní Přírodní Science Foundation Číny (nos. 81773977 a 81774204).
