Abstrakt
Karbendazim, jako fungicid, se běžně používá ke kontrole houbových chorob v zemědělství, lesnictví a veterinární léčivé přípravky. V této studii, akutní a reprodukční toxicity karbendazimu byla hodnocena pomocí Caenorhabditis elegans (C. elegans) jako model, aby se předběžně vyhodnotit potenciální rizika tohoto fungicidu v zemědělské výrobě a aplikaci. Výsledky ukázaly, že růst C. elegans byl inhibován 0,01 µg/L karbendazimu. Léčba 0, 1 µg / L karbendazimu způsobila významné snížení pohybového chování a významné poškození reprodukčního a antioxidačního systému, což způsobilo drastické zkrácení životnosti nematodů. Tyto výsledky poskytují lepší pochopení rizika karbendazimu pro životní prostředí a vyvolávají nové obavy ohledně bezpečnosti.
1. Úvod
Pesticidy, druh chemických nebo biologických činidel, jsou široce používány v zemědělství k regulaci růstu rostlin a kontrolu chorob a hmyzích škůdců, které mohou podporovat růst plodin a zlepšují výnos plodin . Široké používání pesticidů však povede k různým stupňům reziduí v plodinách nebo potravinách, a tím ovlivní lidské zdraví . Problémy reziduí pesticidů nejen přitahovaly velkou pozornost spotřebitelů, ale také se staly jedním z klíčových faktorů ovlivňujících bezpečnost potravin .
karbendazim, jako širokospektrální fungicid, se používá k potlačení houbových chorob v zemědělství, lesnictví a veterinárních léčivech . Nicméně, karbendazim je zařazen do kategorie nebezpečných chemických látek Světové Zdravotnické Organizace a byla zařazena do seznamu prioritních endokrinní narušení chemických látek u Evropské Komise . V posledních letech, je zřejmé, že rozšířené používání karbendazim s přes-rozsah a předávkování, a skutečnost, že karbendazim je těžké být degradován oba vedou k problému karbendazim, rezidua v zemědělství . Ačkoli toxické účinky karbendazimu byla hlášena od roku 1980, toxicita karbendazimu se stává horkým tématem, protože z rostoucí obavy o životní prostředí endokrinními disruptory . Karbendazim byl v několika zemích zakázán kvůli jeho negativním dopadům na životní prostředí a zdraví, jako jsou vývojové a reprodukční poruchy, toxicita a Mutagenita . Nežádoucí účinky karbendazimu na biochemické, histopatologické a hematologické parametry v játrech, ledvinách a endokrinních žlázách a jejich hormonální hladiny byly ilustrovány u potkanů . Kromě toho potřebuje další studium nízké koncentrace v důsledku reziduí karbendazimu.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), jako důležitý výzkumný model, je široce používán k nějakému hodnocení. Podle Amrit et al. , C. elegans má mnoho výhod, jako je malá velikost, rychlá doba výroby, snadná kultivace v laboratoři a krátká životnost dospělých. C. elegans byl v této studii vybrán jako modelový organismus pro hodnocení toxicity nízké koncentrace karbendazimu, kterou lze považovat za referenční hodnotu pro aplikaci karbendazimu v zemědělství.
2. Materiály a metody
2.1. Chemické látky a kmeny
karbendazim (Čistota ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Šanghaj, Čína) byl rozpuštěn v N, N-dimethylformamidu (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Šanghaj, Čína) k výrobě 1 g / L karbendazim originální řešení. Koncentrace DMF byly 0,1% v konečných expozičních roztocích (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/L). Kontrolní skupinou byla 0,1% DMF bez karbendazimu. C. elegans (divoký typ N2) byly původně získány z genetického centra Caenorhabditis (University of Minnesota, MN, USA). Hlístice byly kultivovány na destičkách růstového média hlístic (NGM), které byly naočkovány Escherichia coli OP50 při 20°C, jak je popsáno. L1-larvální C. elegans byly shromážděny promytím gravidních hlístic bělicí směsí (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Letalita
Karbendazim originální řešení (1 g/L) byly zředěný s kapalným médiem (1.12 g K2HPO4, 5.92 g KH2PO4, a 5.85 g NaCl byly ředěny 1 L vody), aby konečné karbendazim koncentrace 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, a 1 mg/L, která obsahovala 0,1% v DMF. Kontrolní skupinou bylo kapalné médium s 0,1% DMF. 30 hlístic (L4) bylo testováno v 96 jamkových destičkách pro každou koncentraci. Přežití hlístic bylo počítáno pod mikroskopem po kultivaci po dobu 24 hodin v inkubátoru. Proces testu je založen na metodě Xiang et al. . Byly zapotřebí tři paralelní experimenty.
2.3. Lokomoční Chování
alespoň 10 ° C. elegans (L4) byly vybrány náhodně z každé koncentrace určit lokomotiva chování, který byl zaznamenán u obou hlavě-thrash frekvence a tělo se ohýbat krát . Počet frekvence head-thrash byl počítán změnami ve směru ohybu ve středu těla C. elegans za 1 min. Měření ohybu těla bylo definováno jako časy směrových změn části hlístic kultivovaných v NGM bez E. coli OP50 za 30 s.
2.4. Byly analyzovány testy růstu a vývoje
C. elegans vystavené karbendazimu po dobu 24 hodin. Délka těla hlístic vystavených karbendazimu byla hodnocena softwarem Image J. Potomci každého C. elegans z larev L4 do dne 1 byl zaznamenán ve fázi L3 po individuálním přenosu na novou desku každý den, dokud reprodukce nepřestala . Byly provedeny nejméně tři paralelní testy.
2.5. Životnost Analýzy
C. elegans testovány na životnost byly kultivovány ve stejném stavu při teplotě 20°C. synchronizované C. elegans byly kultivovány v NGM desky s různou koncentrací karbendazim do 4.dne. Testované hlístice by pak byly přeneseny do nových NGM desek každé 2 dny. Přežívající a mrtvý C. elegans byly zaznamenávány denně (počínaje prvním dnem dospělosti), dokud všechny hlístice pro každou koncentraci nezemřely . Byly provedeny nejméně tři paralelní testy.
2.6. Stanovení Oxidativního Poškození
Intracelulární ROS bylo měřeno s 2′,7′-dichlorodihydrofluoroscein diacetát (H2DCFH-DA), která je nejčastější a citlivou reaktivní kyslík detekce sondy zdaleka. Divoký typ N2 C. elegans byly promyty v pufru M9 a poté ultrazvukem narušeny. Supernatant byl analyzován na úrovni ROS podle pokynů soupravy ROS. Konečná pracovní koncentrace H2DCHE-DA byla 10 μΜ . Vlnové délky excitace a absorbance emisí byly 485 nm a 535 nm. Byly provedeny nejméně tři paralelní testy.
Intracelulární celkem superoxiddismutázy (SOD) byla stanovena podle pokynů T-SOD kit koupil od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Po třikrát promytí M9 byly vyšetřené hlístice ultrazvukem narušeny a reagovaly pomocí soupravy T-SOD. Vlnová délka absorbance byla 550 nm. Kromě toho byl supernatant použit pro detekci hladiny proteinu pro každou koncentraci, ve které byla vlnová délka absorbance 595 nm. Byly provedeny nejméně tři paralelní testy.
2.7. Analýza dat
všechna data byla dána jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM) pomocí jednosměrné ANOVA. Grafy byly prezentovány pomocí Origin 8.5 A GraphPad Primer 7 a statistická analýza byla provedena pomocí softwaru SPSS 19.0. Úroveň statistické významnosti byla provedena za použití a .
3. Výsledky
3.1. Stanovení pohybového chování C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans po akutních expozicích karbendazimu analýzou údajů o frekvenci hlavy-thrash a časech ohýbání těla hlístic(Obrázky 1 (A) a 1 (b)). Oba vykazovaly významné snížení koncentrací karbendazimu v rozmezí od 0, 01 µg / L do 100 µg / L (). Kromě toho se údery hlavy hlístic vystavených 100 µg / L snížily na 68,27%. Pro tělo ohýbá test, kdy karbendazim koncentrace byla 10 µg/L a 100 µg/L, to mělo významný inhibiční účinek na tělo ohýbá ze C. elegans tím, 36.77% a 35.48% ve srovnání s kontrolou, resp.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Stanovení růstu a vývoje C. elegans po Karbendazim Akutní Expozice
ve Srovnání s kontrolní skupinou (obr. 1(c) 1(d)), délka těla a povrchu těla byly výrazně () snížena v expozici skupiny od 0,01 µg/L do 100 µg/L. Oba byli snížil o 19.16% a 22.15% na léčbu 0.01 µg/L, ve srovnání s kontrolní skupinou, respektive. Koncentrace 10 µg/L prezentovány nejvíce negativní dopady, a délka těla a povrchu těla C. elegans byly sníženy o 35,21% a 65.22% ve srovnání s kontrolní skupinou, respektive.
3.3. Stanovení Plod Velikosti C. elegans po Karbendazim Akutní Expozice
Podle Obrázku 2, plod velikosti hlístice měl významný pokles () v léčbě skupin od 0,1 µg/L do 100 µg/L. plod velikosti C. elegans poklesl nejvíce významně, který snížil na 43.71% s léčbou 10 µg/L ve srovnání s kontrolní skupinou.
3.4. Stanovení životnosti C. elegans po akutních expozicích karbendazimu
životnost C. elegans byla významně inhibována 0,01 µg / L až 100 µg/L karbendazim podle křivky životnosti znázorněné na obrázku 3. Výsledky ukázaly, že životnost C. elegans byla snížena z 24 na 20 dní při léčbě 0,01 µg/L karbendazimu. Životnost nematodů léčených karbendazimem 0, 01 µg / L byla snížena o 20, 00%. Když byla expoziční koncentrace karbendazimu 100 µg / L, životnost C. elegans byla nejvíce snížena o 45,83%.
3.5. Účinky Akutní Expozice Karbendazim na Antioxidační Systém C. elegans
ROS úrovně kontroly a ošetřeného C. elegans na karbendazim expozice pro různé koncentrace jsou uvedeny na Obrázku 4(a). Bylo indikováno, že hladina intracelulárního ROS byla významně zvýšena () v rozmezí od 0,01 µg/L do 100 µg/L karbendazimu. Ve srovnání s kontrolou, ROS úroveň byla zvýšena nejvíce o 70.60% s léčbou 10 µg/L. Podle výsledků intracelulární hladiny SOD, měla zvýšit na léčbu od 0.01 µg / L až 100 µg/L karbendazim (obrázek 4 b)). Hladina SOD byla zvýšena o 10,70% při 0,1 µg / L karbendazimu ve srovnání s kontrolní skupinou.
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Diskuse
karbendazim, jako fungicidy, je široce používán v zemědělství k inhibici růstu hub. Použití karbendazimu bylo zakázáno v Austrálii, většině Evropské unie a USA kvůli jeho závažné toxikologii a přetrvávající povaze . Pro tuto studii bylo poprvé použito C. elegans jako modelové organismy k vyhodnocení účinků karbendazimu na pohybové chování, růst a vývoj, reprodukci, životnost a antioxidační systémy. Výsledky navíc ukázaly, že měl negativní vliv na C. elegans.
Podle 24 h-LC50 akutní toxicita koncentraci C. elegans vystavené různé koncentrace karbendazim je 0.867 mg/L 96 h LC50 karbendazimu v reakci na danio pruhované byl znázorněn jako 1,75 mg/L . Vejce Pruský kapra Carassius gibelio ukázaly, že toxicita účinky na koncentrace 0,036 mg/L . Studie ukázaly, že růst a vývoj Navicula sp. je inhibována karbendazim s 24 h-EC50 hodnota 2,18 mg/L. Když se míra růstu řas je zotavil po 72 h expozice, chlorofylu a obsah zůstává výrazně snížil při léčbě karbendazimu byla nad 0,5 mg/L . V této současné době, C. elegans vystavených nízké koncentrace karbendazim byly vybrány tak, aby posoudit jeho účinky v závislosti na aktuální koncentraci denní expozice. Nízké koncentrace karbendazimu neznamenají, že je Bezpečný. Karbendazim vykazuje v některých studiích negativní biologické účinky při mnohem nižších dávkách.
lokomotivní chování bylo hodnoceno za účelem posouzení neurotoxicity C. elegans (larva L4) po 24hodinové expozici karbendazimu. Výsledky ukázaly, že karbendazim by mohl mít negativní vliv na chování lokomotivy detekcí mlácení hlavy a ohýbání těla C. elegans, které byly oba citlivější ve skupině s vyšší expozicí. Pohybové chování embryí zebrafish vystavených karbendazimu je citlivé . Předchozí studie ukázaly, že ryby mají abnormální chování, když subletální koncentrace karbendazimu jsou 0, 22-0 ,43 mg / l.
vývojové malformace mohou být také jedním z důvodů abnormální lokomoce . Růst a vývoj C. elegans byly testovány v naší studii. Výsledky ukázaly, že délka těla a plocha těla C. elegans byly významně zúženy při léčbě vyšší než 0, 01 µg/L karbendazimu. Normální růst obratlovců souvisí s metabolickou homeostázou hormonu štítné žlázy . Williams a kol. ukázaly, že karbendazim může způsobit ztrátu spermií po implantaci, malformaci plodu a pomalý růst a vývoj.
reprodukční toxicity karbendazimu prokázáno, že karbendazim může inhibovat mikrotubulové polymerace houbových a savčích buněk, což způsobuje narušení mikrotubulové shromáždění tím, že jednají s β-tubulinu, což vede k narušení segregace chromozomů v procesu dělení buněk . Tvorba mikrotubulů nekovalentními vazbami α – a β-tubulinu je zodpovědná za segregaci chromozomů v procesu mitózy a meiózy . Velikost plodu C. elegans významně klesá při koncentraci 0, 1 µg / L karbendazimu. Bylo zjištěno, že karbendazim ovlivňuje reprodukční systémy u japonských křepelek a křečků . Dospělo se k závěru, že životnost C. elegans byla významně snížena s koncentrací karbendazimu ≥0,01 µg / L na základě naší studie. Studie ukázaly, že karbendazim vedl k neplodnosti a vývojové toxicitě a projevuje toxicitu embryí, apoptózu zárodečných buněk a teratogenezi u různých druhů savců .
apoptóza je komplexní programovaná buněčná smrt, což je vysoce regulovaný jev charakterizovaný řadou buněčných procesů . Mnoho studií ukázalo, že produkce ROS indukovaná oxidačním stresem souvisí s apoptotickou buněčnou smrtí . Naše studie zjistila, že karbendazim může vyvolat významné zvýšení hladiny hodnot ROS a malé zvýšení hladiny hodnot SOD. Oxidační stres způsobený znečištěním životního prostředí indukuje zvýšenou expresi ROS a následně poškozuje antioxidační obranný systém . SOD je zodpovědný za detoxikaci toxických volných radikálů a jejich aktivity, které se používají k vyhodnocení úrovně oxidačního stresu a stavu buněčných antioxidantů . Metalloenzyme SOD urychluje transformaci endogenní cytotoxické superoxid radikály na H2O2, a zvýšení SOD výraz úrovní může přispět ke zlepšení enzymových aktivit s cílem odstranit superoxid radikály vyvolané karbendazim a aby se zabránilo vzniku buněčné dysfunkce v průběhu expozice karbendazimu . Vyšší koncentrace expozice karbendazimu může způsobit silné oxidační stres, který následně ničí rovnováhu buněčné homeostázy a podporu apoptózy . Karbendazim v nízkých koncentracích by však podle našich výsledků mohl ještě významně poškodit reprodukční systém.
5. Závěr
Pokud víme, tato studie hodnotila bezpečnost karbendazimu vystaveného C. elegans poprvé. Ukázalo se, že karbendazim může mít škodlivý vliv na pohybové chování, vývoj a růst, reprodukci, životnost a antioxidační systém C. elegans. Doufám, že na základě výsledků musí věnovat větší pozornost aplikaci karbendazimu. Kromě toho je třeba dále vyhodnotit bezpečnost karbendazimu pro použití, zejména Bioakumulační toxicitu a potenciální genotoxické účinky.
dostupnost dat
všechna data generovaná nebo analyzovaná během této studie jsou zahrnuta v tomto článku.
střet zájmů
autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.
poděkování
tento výzkum byl podpořen Národní přírodovědnou nadací Číny (31501569).
